分子印迹技术在农药残留检测中的应用

郭怡光，关 瑾

（沈阳化工大学 应用化学学院， 辽宁 沈阳 110142）

农药是现代农业重要的组成部分，农药使农业生产的质量和产量得到了保障，农药的进步推动了农业生产的提高。然而长期的使用，农药在环境中不断积累使残留量超标，造成广泛的负面影响：随着自然循环不断扩散，影响生态平衡，经食物链传递过程进入人体，威胁人体健康[1]。人们逐渐认识并越来越重视农药残留的问题，各国有关部门也对农药残留制定了严格的标准。有效的农药检测手段可以帮助人们了解农药残留水平，有助于解决残留问题。

农药残留的检测主要包括样品的前处理和样品的测定两个部分。样品的前处理过程是在样品中富集目标待测物、对杂质进行净化，前处理过程会影响整个检测的灵敏度和准确性。传统的前处理过程包括固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）等方法，这些方法无法有效消除复杂样品中杂质对测定的干扰。传统的检测方法主要是色谱法（LC/GC）和质谱法（MS），分子印迹技术(Molecularly Imprinted Technology, MIT)是合成对某一种或某一类分子具有特异性吸附能力的聚合物的技术。利用该技术所获得的的分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymers, MIPs）具有结构预定、特异性识别、性质稳定、适用范围广等特点，引起了广泛关注。由于其独特的特异性吸附性质，被应用于固相萃取、色谱分离、化学传感器、模拟酶催化等方面[2-5]。近年来在药物分析、环境监测、食品安全等领域得到了广泛应用[6-8]。本文主要介绍分子印迹技术在农药检测中的应用。

1 分子印迹技术的原理和合成方法

分子印迹技术发展自分子免疫学，1993年瑞典的Mosbach在《Nature》上发表了关于茶碱MIPs的研究报道[9]，引起人们的关注，之后该技术得到了广泛研究并取得了很大的进步。

分子印迹技术的原理与抗原抗体专一性结合性类似，合成的 MIPs材料拥有大量的识别点位，这些识别点位是与目标分子的大小、形状、功能基团吻合的三维孔穴，MIP通过识别点位可以对目标分子进行特异性识别[10]。这个特点使采用分子印迹技术的检测方法可以对各种复杂基质中的目标分子进行测定。由于分子印迹材料合成过程会有模板分子残留造成“模板泄漏”现象，影响测定结果，人们使用有与待测分子类似官能团和大小的“假模板”分子代替原模板，有更好的测定效果，同时可以测定多种同类的分子。

分子印迹的合成过程一般包括：将功能单体与模板分子按一定比例混合放置一定时间进行预聚合；之后使用交联剂将功能单体聚合，使功能单体的空间位置和排布方式固定下来；最后通过物理或化学方法将模板分子洗脱下来，留下的为具有大量特异性识别点位的分子印迹聚合物[11]。分子印迹合成一般需要的以下几种原料：以目标待测分子或类似分子作为模板分子；根据模板分子性质选择合适的功能单体；将模板分子与功能单体结合成刚性的聚合物的交联剂；提供自由基促进反应进行的引发剂；提供适合反应条件的反应溶剂。分子印迹合成常用的方法有以下几种：（1）本体聚合法[12]。（2）原位聚合法[13]。（3）悬浮聚合法[14]。（4）沉淀聚合法[15]。（5）表面聚合法[16]。

2 分子印迹技术在农药残留中的应用

环境和食品中的农药残留会导致一系列的问题，影响生态平衡，威胁人和生物的健康。近年来新型的农药使用逐渐增多，这些农药一般具有高效低用量的特点，农药的残留量可达ppm级别。农药残留样品（植物、动物、土壤等）成分复杂，对检测结果造成影响的物质种类多，含量大。传统的检测方法常常无法有效克服基质造成的干扰，分子印迹技术具有的特异性吸附特点可以有效解决上述问题，在农药残留的分析中的得到了应用。

2.1 样品前处理中的应用

2.1.1 分子印迹固相萃取（MISPE）

传统的固相萃取技术发展自色谱分离技术，是利用样品中各物质与固定相流动相的极性关系进行分离。对于复杂样品，极性相似的杂质无法有效去除。分子印迹技术的引入形成的分子印迹固相萃取技术（Molecularly Imprinted Solid—Phase Extraction,MISPE）很好地解决了这个问题。MISPE是目前在农药残留方面应用最广泛，并且得到了商用化的一种技术。

Davoodi D等[17]合成了杀虫剂二嗪农分子印迹聚合物作为固相萃取填料，对固相萃取条件进行了优化，使用高效液相色谱紫外检测器进行测定。测定结果为，在0.025～10 mg/kg范围内线性良好，在水溶液中的回收率为77%～98%，对黄瓜样品的回收率为82%～110%，日间精密度和日内精密度分别为8.26%和9.7%。该方法证明了MISPE具有对快速、灵敏。低成本地测定样品的潜力。Tang K等[18]用吡嘧磺隆为模板，合成了磺酰脲除草剂的分子印迹聚合物作为固相萃取填料，对稻谷样品中的磺酰脲除草剂进行了测定。结果在五种样品中测到了吡嘧磺隆，一个样品中测到苄嘧磺隆。传统分子印迹聚合物在水相条件下吸附效果非常差，合成亲水性分子印迹聚合物是新的发展方向。He J等[19]以马拉硫磷作为模板，以甲基丙烯酸缩水甘油酯为功能单体，合成了一种新型的亲水性分子印迹聚合物。将MIPs作为固相萃取填料测定了蜂蜜中六种有机磷杀虫剂的含量，该方法的在 0.01～1.0 μg·mL-1范围内线性良好，检测限在 0.0005～0.0019 μg·mL-1，RSD 在 2.26%～4.81% (n=6)，回收率在90.9%～97.6%。该方法是一种简单快捷有效的样品前处理方法。分子印迹固相萃取法虽然存在耗时长、步骤繁琐等问题，但该方法操作简单、合成比较容易，在国内外应用较广[20-22]。

2.1.2 分子印迹分散固相萃取

分散固相萃取（DSPE）是在固相萃取基础上进行改进的固相萃取技术。将固相萃取材料直接加进样品溶液或样品萃取溶液中进行吸附，再将吸附到的成分洗脱下来进行测定。相较于SPE，固相萃取才材料分散在溶液中接触面更大，提取效率更高节省时间，不需要考虑溶液的流速对提取效果的影响。结合分子印迹技术，该方法具有提取效果好、节省时间的优点。分子印迹分散固相萃取材料使用本体聚合、沉淀聚合、表面聚合等方法进行合成。Zhao Q等[23]通过硬模板法合成了三嗪类农药单孔空心分子印迹球，具有优于沉淀聚合和表面聚合的结合容量，Peng Y等[24]制备了除草剂甲磺隆的分子印迹聚合物，采用表面聚合法，以二氧化硅纳米粒子为核，在表面甲基化将可供聚合的双键直接与二氧化硅表面，在此基础上形成可控厚度的分子印迹材料。得到分子印迹聚合物作为分散固相萃取材料对土壤、水稻、大豆和玉米样品进行测定。回收率较高，证明该材料可以测定土壤与作物样品。Lu Q等[25]对毒死蜱分散固相萃取材料进行了研究。

磁性分子印迹技术是对分子印迹分散固相萃取的一种改进。在硅胶微粒的核心加入四氧化三铁纳米颗粒，可以将分散固相萃取吸附后的离心过程优化为使用磁铁吸引，最大可能的避免了少量固相萃取材料损失造成的测定误差。同时引入四氧化三铁纳米颗粒具有顺磁性和良好的悬浮性，提取效果良好。马桂服[26]以毒死蜱为模板合成了磁性分子印迹材料，结合高效液相色谱仪对大米中的毒死蜱进行了测定，在三个加标水平下，回收率在81.2%～92.1%之间，检出限为 0.0072 μg/g，日间精密度和日内精密度分别为3.5%～7.3%和2.4%～4.6%。证明该方法可以有效处理复杂基质。Xu S等[27]通过逐层自主装工艺合成了磁性分子印迹聚合物。合成实验甲基对硫磷为模板，甲基丙烯酸和4-乙烯基吡啶作为双单体。对聚合物的结构表征，聚合物直径约100 nm，十分均匀。利用该材料对土壤样品进行了测定，回收率在81.1%～87.0%，检测限在5.2 ng·g-1。国内外对此方面进行较多的的研究[28-30]。

2.1.3 其他的分子印迹前处理方法

分子印迹固相微萃取（MI-SPME）分子印迹技术和固相微萃取进行了结合，克服了原有的材料的可检测物质种类较少的缺点，结合SPME吸附效果好，自动化程度高的优点，是很有前景的检测方法。在农药残留的检测方面有应用。Wang Y L 等[31]利用溶胶凝胶法，以二嗪农作为模板，聚乙二醇为功能单体合成的分子印迹聚合物作为SPME涂层。对几种蔬菜中的的二嗪农类似物进行了测定，检测限在0.017～0.77 μg·kg-1范围，回收率为 81.2%～ 113.5%，结果证明该方法优于商业SPME纤维。Turiel E等[32]将MIP技术与固相微萃取中空纤维组合成了新的方法，用于侧丢你跟水中的三嗪类农药。优化后提取条件为，在20%氯化钠条件盐析，在750 r/min下提取45 min，用甲苯洗涤5 min后用甲醇/乙酸（95/5）洗脱。该检测方法的标准偏差小于 10.6%，检测限在ng·mL-1水平。研究人员对三嗪类、抗蚜威等农药进行了研究[33,34]。

固相萃取搅拌棒（SBSE）是另一种比较新型的固相微萃取方法。由于固定相面积较大，吸附时接触较好，所以该方法提取效果好于SPME法。与分子印迹技术的结合而成的分子印迹固相萃取搅拌棒（MI-SBSE）可以拓宽该技术的应用面，在农药残留检测方面得到了应用。Díaz-Álvarez M等[35]将磁性纳米分子印迹材料聚合在搅拌棒上，并对合成和提取条件进行了优化，测定了土壤样品种的三嗪类农药。测定的结果为该方法选择性较高，标准偏差较小。该方法坚固耐用，可以对于复杂基质进行测定[36-38]。

2.2 化学传感器的应用

以分子印迹聚合物作为敏感材料的分子印迹传感器是是一种新的检测技术。该方法以 MIPs代替传统的生物敏感材料，克服了以酶、抗体等生物活性材料对操作环境要求较高、储存困难的缺点，同时保留了选择能力强、灵敏度高的特点。工作原理是：模板分子进入敏感层，与识别点位结合后，通过换能器将识别到的信号换成电流变化、荧光强度变化等可记录的信号。多数目标化合物都可以合成分子印迹材料，化学传感器应用范围很广，在农药残留中也有较多应用。

2.2.1 分子印迹电化学传感器

分子印迹电化学传感器是将电信号转换装置与分子印迹敏感材料进行结合，将目标待测农药与传感器结合后，经传感器转换为各处理电信号。分子印迹电化学传感器常采用两种合成方式：合成分子印迹材料后涂覆于电极表面；将分子印迹材料直接合成与电极上。涂覆的方法比较简单，但是存在分子印迹涂层易脱落的问题，现在直接合成与电极表面的方法比较常见。Tan X等[40]制备了氧化石墨烯和金纳米颗粒修饰的分子印迹电化学传感器，以克百威作为模板分子，甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，马来松香丙烯酸乙二醇酯（EGMRA）作为交联剂进行合成。该方法在5.0×10-8～2.0×10-5mol/L范围线性良，检测限为2.0×10-8mol / L（S / N = 3），并对蔬菜样品进行了测定。胡文英等[41]以叶蝉散为模板，采用自主装合成至玻碳电极上。采用脉冲伏安法测量，并对水果中的叶蝉散残留进行了测定，该方法线性良好检出限可达1.05×10-8g/L。采用不同的电极或对电极进行修饰可以增强增强信号，降低检测限，得到更好的测定结果，Bakas I等[42]基于网印碳电极进行合成分子印记传感器，Li S[43]等采用用多壁碳纳米管负载Pd-Ir纳米复合催化剂与亚甲基蓝信号放大的手段增强了信号。

分子印迹光化学传感器主要分为两种：MIPS荧光传感器和MIPs化学发光传感器。MIPs荧光传感器是利用荧光膜与待测物结合后产生的荧光信号变化进行测定。MIPs化学发光传感器是利用化学反应中物质吸能产生能级跃迁而形成的发光现象进行测定。Feng S等[44]开发了一种新型分子印迹增强拉曼光谱/比色双传感器，测定苹果汁中的毒死蜱。通过比色法快速鉴别和半定量分析大于 5 mg·L-1的毒死蜱。通过紫外-可见光法准确定量 0.1～10 mg·L-1范围的毒死蜱。该方法十分快速，仅需25 min。

3 结 论

农药残留检测常常遇见基质复杂浓度低，影响结果准确性。分子印迹技术性质稳定，专一性强，在农残检测方面得到了广泛的应用。分子印迹技术可以有效改善农残分析前处理中杂质干扰的问题；结合化学传感器技术可以提供稳定、快速、准确的检测效果，是未来发展的方向。随着分子印迹技术的发展，该技术会越来越多的应用在农残检测中，提供准确的检测结果。

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