鸡白介素18与鸡γ干扰素基因融合表达载体构建

李晓婷，宋佰芬，崔玉东

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院）

鸡白介素18与鸡γ干扰素基因融合表达载体构建

李晓婷1，宋佰芬2，崔玉东1

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院）

为了研究新型细胞因子制剂，构建鸡白细胞介素18和鸡干扰素γ的基因融合表达载体。无菌提取鸡脾细胞的总RNA，以其为模板经过RT-PCR的方法分别扩增出ChIL-18和ChIFN-γ基因片段，并连接到pMDTM18-T克隆载体上，构建重组质粒pMDTM18-T-ChIL-18和pMDTM18-T-ChIFN-γ。以重组质粒pMDTM18-T-ChIL-18和pMDTM18-T-ChIFN-γ为模板，利用多肽氨基酸接头和overlap技术，获得ChIL-18-ChIFN-γ融合基因并连接到克隆载体pMDTM18-T上，经PCR、酶切及测序鉴定正确后连接到pET32a原核表达载体中。构建ChIL-18-ChIFN-γ原核表达载体。为下一步研究二者之间的作用关系及抗病毒功能奠定了基础。

鸡白细胞介素18；鸡干扰素γ；overlap；原核表达载体

白介素18（interleukin-18，IL-18）在结构上属于IL-1家族，在功能上与IL-12相似[1]，鸡IL-18作为免疫佐剂，具有增强免疫和治疗作用[2]。白细胞介素18又叫IFN-γ诱导因子，IL-18介导Thl型细胞反应，刺激IFN-γ的产生。分泌白介素18的细胞主要是单核巨噬细胞系，其具有多种生物学功能。白介素18能增强CTL细胞和NK细胞的活性，增强Fas介导的细胞毒作用[3]，促进T细胞增殖[4]。在增强免疫、抗肿瘤、抗病原微生物感染、抑制病毒活性等方面有着潜在的应用前景。IL-18具有免疫佐剂的作用，已经证明IL-18能明显增加IFN-α的抗病毒活性[5]。白介素18能够刺激Thl等细胞产生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等细胞因子[6-7]。Digby等[8]于1995年成功克隆鸡干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）的基因，随后，进一步研究发现IFN-γ是机体发挥免疫功能[9]，清除体内病原体不可缺少的成分。IFN-γ，又被称为免疫干扰素，主要由活化的T淋巴细胞及NK细胞产生。IFN-γ具有强效免疫调节，抗肿瘤，和抗病毒特性的细胞因子[10]。IFN-γ参与诱导MHC类抗原的表达和免疫调节效应的重要作用，IFN-γ可以提高机体抵抗力、增强巨噬细胞的吞噬活性以及淋巴细胞对靶细胞的特殊细胞毒性[11]。禽IFN-γ具有增强机体二次免疫应答、提高机体抵抗力和促进生长等作用，是一种有效的免疫佐剂和治疗型制剂。很多研究也证明白介素18和干扰素γ具有抗病毒的功能。因此备受国内外研究者的关注。

实验采用overlap的方法，将重组质粒ChIL-18和ChIFN-γ串联在一起，构建ChIL-18-ChIFN-γ的克隆和原核表达载体。使得IL-18和IFN-γ能同时发挥作用，利用IL-18能促进IFN-γ分泌研究IL-18作为外源佐剂的作用，以及对IFN-γ抗病毒活性的影响。为后续研究二者是否具有免疫相关性以及该蛋白是否具有较单独蛋白更强的抗病毒活性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠埃希菌Escherichia coli BL21、DH5α菌株购自天根生化科技有限公司，质粒载体pET-32a由实验室保存，克隆载体pMDTM18-T购自宝生物公司。

1.1.2 试剂

LPS购自上海生工有限公司；ConA、氨苄青霉素和IPTG购自Sigma试剂公司；trizol购自ambion公司；反转录试剂盒和DMEM改良型RPMI-1640培养液购自赛默飞世尔科技有限公司；胎牛血清（FCS）购自GIBCO公司；Taq DNA聚合酶购自Trans公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；限制性内切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ）购自Fermentas公司；质粒提取及DNA纯化试剂盒购自Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

用primer5辅助设计引物，根据GeneBank登陆的ChIL-18（gb|AY775780.1|）基因序列设计上游和下游引物F1、R1，上游引入酶切位点BamHⅠ，下游引入酶切位点HindⅢ；ChIFN-γ（gb|FJ788637.1|）基因序列设计上游和下游引物F2、R2上游引入酶切位点EcoRⅠ，下游引入酶切位点HindⅢ；设计人工肽段linker（（G4S）3）将鸡白介素18和鸡干扰素γ融合，命名为ChIL-18-ChIFN-γ，采用overlapPCR方法设计连接白介素18和干扰素γ的引物P1、P2，分别引入酶切位点BamHⅠ和HindⅢ。引物均由上海生工合成。实验所用引物详见表1，下划线代表引入的Enzyme loci。

表1 试验所用引物Table 1Primer used in the experiment

1.2.2 ChIL-18和ChIFN-γ目的片段的获得

1.2.2.1 鸡脾淋巴细胞总RNA的提取

提取鸡脾脏淋巴细胞总RNA，具体实验方法参照文献[12]。方法如下：无菌取本地三黄鸡鸡脾，收集单层淋巴细胞。在37℃含5%CO2的培养箱中培养2小时后分别加10 μg·mL-1的LPS和10 μg·mL-1的ConA刺激物培养12小时。取出后按trizol说明书提取细胞总RNA。测RNA浓度，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取物。

1.2.2.2 RT-PCR扩增目的基因

将提取的细胞总RNA利用thermo逆转录试剂盒进行逆转录，在无Rnase的0.5 ml EP管中加入提取的RNA 3 μL，随机引物1 μL，DEPC水8.5 μL于65℃作用5 min，再加buffer 4 μL，dntp 2 μL，逆转录酶1 μL，逆转录酶抑制剂0.5 μL在42℃作用2 h，再于72℃作用10 min，获得的产物为cDNA。以此cDNA为模板进行PCR扩增，将利用LPS刺激细胞获得的cDNA用F1和R1进行PCR扩增，利用ConA刺激细胞获得的cDNA用F2和R2进行PCR扩增。取5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察结果。

1.2.2.3 ChIL-18和ChIFN-γ目的基因片段的克隆

将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在280 nm波长的紫外光照射下切取目的条带，利用胶回收试剂盒进行回收纯化DNA。用获得的目的DNA利用连接仪连接到pMDTM18-T载体上。将反应产物导入到装有大肠杆菌感受态细胞Dh5α中，将培养好的菌液均匀涂到含有0.1%AMP+抗性的固体LB培养基上，37℃倒置培养8-12 h。挑取阳性菌株接种到3 mL含有0.1%AMP+抗性的液体LB培养基中进行37℃，180 rpm·min-1震荡培养10～12 h，进行PCR、测序和双酶切鉴定。

1.2.3 ChIL-18-ChIFN-γ融合表达载体的构建

1.2.3.1 ChIL-18-ChIFN-γ融合基因的构建

参照文献[13]，用F1、P1引物对，以pMDTM18-TChIL-18为模板，以及P2、R2引物对，以pMDTM18-T-ChIFN-γ为模板进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收纯化ChIL-18和ChIFN-γ。回收的目的片段各自带有linker的上游和下游，将两种片段各取1 μL混合后用作模板，以F1、R2为引物，P1、P2引物中的linker相互结合将两段片段串联在一起，形成融合基因ChIL-18和ChIFN-γ，进行PCR扩增。产物利用胶回收试剂盒回收纯化目的片段。

1.2.3.2 ChIL-18-ChIFN-γ融合基因的克隆、测序

将1.2.3.1中回收回来的PCR产物定向导入到pMDTM18-T载体中，转化到Dh5α感受态细胞中，37℃震荡培养1 h后将菌液均匀涂到含有0.1% AMP+抗性的固体LB培养基上，倒置培养8～12 h后，挑取阳性克隆菌株转接到含有0.1%AMP+抗性的LB培养液中。筛选阳性菌株送到吉林库美生物工程有限公司测序鉴定。将鉴定正确的阳性菌株采用质粒提取试剂盒提取阳性质粒pMDTM18-T-ChIL-18-ChIFN-γ。加BamHⅠ和HindⅢ对质粒进行双酶切后连接到同样被BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pET-32a质粒中，将构建好的pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中。经培养后筛选阳性菌株送到吉林库美生物工程有限公司测序鉴定。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增ChIL-18和ChIFN-γ

以提取的总RNA逆转录产物cDNA为模板，分别用F1、R1和F2、R2两组引物PCR扩增出目的片段长度为597 bp的ChIL-18和495 bp的ChIFN-γ。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期大小相符，如图1。

图1 ChIL-18和ChIFN-γ的凝胶电泳结果Fig.1Gel electrophoresis results of ChIL-18 and ChIFN-γ

2.2 ChIL-18和ChIFN-γ片段的克隆

将上述PCR产物连接到pMDTM18-T载体上，转化到大肠杆菌后进行PCR、双酶切和测序鉴定。测序结果中ChIFN-γ与GeneBank登陆ChIFN-γ（gb｜FJ788637.1｜）基因序列BLAST结果完全一致，ChIL-18与GeneBank登陆的ChIL-18（gb｜AY775780.1｜）基因序列BLAST结果显示存在两个点突变，而其中一个点突变导致一个氨基酸突变。PCR鉴定结果如图2，双酶切鉴定结果如图3。

2.3 ChIL-18-ChIFN-γ融合基因的构建

以胶回收PCR产物ChIL-18和ChIFN-γ各取1 μL混匀为模板，用F1、R2引物对混合物进行PCR扩增，获得大小为1128 bp的ChIL-18-ChIFN-γ。目的片段的长度与预期相一致。说明采用overlap方法成功构建融合基因。将目的片段连接到pMDTM18-T克隆载体中，经测序鉴定表明成功构建克隆菌株pMDTM18-T-ChIL-18-ChIFN-γ。PCR鉴定结果如图4，双酶切鉴定结果如图5。

图2 ChIL-18和ChIFN-γ的PCR鉴定结果Fig.2PCR identification results of ChIL-18 and ChIFN-γ

图3 ChIL-18和ChIFN-γ的双酶切鉴定结果Fig.3Double enzyme digestion of ChIL-18 and ChIFN-γ

图4 pMDTM18-T-ChIL-18-ChIFN-γ的PCR鉴定结果Fig.4PCR identification results of pMDTM18-TChIL-18-ChIFN-γ

图5 pMDTM18-T-ChIL-18-ChIFN-γ的双酶切鉴定结果Fig.5Double enzyme digestion of pMDTM18-TChIL-18-ChIFN-γ

2.4 ChIL-18-ChIFN-γ融合基因表达载体的构建

阳性菌株pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ测序结果表明目的基因序列全长为1 128 bp，与克隆载体测序结果一致。表明成功构建ChIL-18-ChIFN-γ融合基因表达载体。PCR鉴定结果如图6，双酶切鉴定结果如图7。

图6 pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ的PCR鉴定结果Fig.6PCR identification results of pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ

3 讨论

IL-18是一种具有很多种免疫学功能的细胞因子，它在抗肿瘤、抗感染、抗炎症及自身免疫性疾病治疗中都有非常好的应用前景。当病毒侵染机体时先后激活巨嗜细胞中的caspase蛋白酶4、8、9和1、3，然后通过caspase-l将没有活性的IL-18的前体蛋白剪切成为成熟的蛋白。而成熟的IL-18又刺激T细胞和NK细胞分泌IFN-γ。然后IFN-γ和被感染的巨嗜细胞分泌的IFN-γ又能反过来促进caspase蛋白酶的表达[14]。干扰素因其具有广谱抗病毒、抗肿瘤的活性及免疫调节作用，现已成为病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点研究[15]。干扰素γ对多数病毒都具有明显的抑制作用，活性高，可以产生显著的抗病毒作用。ChIL-18蛋白可调节机体免疫功能，明显诱导IFN-γ基因表达，增强疫苗的免疫效果。

图7 pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ的双酶切鉴定结果Fig.7Double enzyme digestion of pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ

研究使用一个柔性的linker利用overlap方法在体外连接ChIL-18和ChIFN-γ基因，该方法简单快速，linker并不会引起两种蛋白的相互影响。串联产物为下一步研究ChIL-18-ChIFN-γ融合蛋白的生物学活性和应用奠定了有力基础。该融合蛋白表达载体的构建为后续研究开发新型多功能、多靶点的细胞因子制剂奠定基础。

一般来说，IFN-γ有比较严格的种属特异性，不同物种之间使用会降低其生物活性。实验采用鸡源的脾脏细胞进行提取RNA，是因为脾脏中含有的T细胞比例较大，其他细胞相对较少。实验克隆到的鸡IFN-γ基因与GenBank中登陆号为gb|FJ788637.1|的核苷酸序列同源性达到了100%，表明鸡IFN-γ基因是比较保守的，而鸡IL-18基因与GenBank中登陆号为gb|AY775780.1|的核苷酸序列同源性为99%，存在两个不同的碱基，BLAST分析仅有一个氨基酸不同，与GeneBank中原序列相比，不同的氨基酸在第101位由原序列的赖氨酸变成精氨酸。进行多次重复试验结果在该位置的氨基酸都为精氨酸，分析原因可能是鸡个体差异。赖氨酸与精氨酸同属于碱性氨基酸，分析该不同氨基酸并不影响整个融合蛋白的生物活性和应用。

4 结论

实验主要采用overlap方法将两段目的基因连接，连接产物具有一株菌表达两种蛋白的优势，为研究他们的共同抗病毒作用奠定了夯实的基础。

［1］李行，韩凌霞.白细胞介素18及其在禽类中的研究进展［J］.中国预防兽医学报，2012，34（9）：752-755.

［2］王宪文，刘兴友，王岩，等.鸡白细胞介素18研究进展［J］.安徽农业科学，2008，36（16）：6776—6777.

［3］Kohno K，Kataoka J，Ohtsuki T，et a1.IFN-gamma-inducing factor（IGIF）is a costimulatory factor on the activation of Thl but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12［J］.J Immunol，1997，158（4）：1541-1550.

［4］Dao T，Ohashi K，Kayano T，et al.Interferon-gamma-inducing factor，a novel cytokine，enhance Fas ligand mediated cytotoxicity of murine T helper I cells［J］.Cell Immunol，1996，173（2）：230-235.

［5］何静，张盼盼，孙敏华，等.鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究［J］.华南农业大学学报，2015，36（1）：18-22.

［6］Okamura H，Tsutsi H，Komatsu T，et al.Cloning of a new cytokine that induces IFN-γproduction by T cells［J］. Nature，1995，378（2）：88-91.

［7］Ushio S，Namba M，Okura T，et a1.Cloning of the cDNA for human IFN-γ 2inducingfactor，expressioninEscherichia coli，and studies on the biologic activities of the protein［J］.J lmmunol，1996，156（11）：4274-4279.

［8］Zhang X Y，Kurth A，Pauly D.Application of high—titred IgY antibodies in orthopox virus diagnostics［J］.J Chin Pharm Sci，2008，17（3）：183-191.

［9］Pal1ly D，Dorner M，Zhang X Y，et a1.M onitoring of laying capacity，immunoglobulin Y concentration，and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period［J］.Poult Sci，2009，88（1）：281-290.

［10］Paulo H，Verardi，Fatema A，et a1.IL-18 Expression Results in a Recombinant Vaccinia Virus That Is Highly Attenuated and Immunogenic［J］.J Interf Cytok Res，2013，34（3）：168-178.

［11］亓立峰，许梓荣.干扰素的分子生物学研究进展［J］.中国营药杂志，2003，37（6）：22-25.

［12］许健，刘岩.鸡白细胞介素18全长基因的克隆、表达及

分子进化分析［J］.科技通报，2007，27（1）：52-58.

［13］曹宏伟，李冬野，刘哲，等.金黄色葡萄球菌wood46株eno基因的克隆及原核表达［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（4）：46-49.

［14］项黎丽，杨红星.鸡白介素-18与鸡α-干扰素融合蛋白克隆及其原核表达载体的构建［J］.河南畜牧兽医：综合版，2013（7）：11-15.

［15］屈艾，汪承润.干扰素及其研究进展［J］.徐州师范大学学报，2002（2）：57-59.

Construction of Chicken Interleukin 18 and Interferon Gamma Gene Fused Expression Vector

Li Xiaoting1，Song Baifen2，Cui Yudong1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；
2.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to study the new cytokine preparation，the fused expression vectors of chicken interleukin 18 and interferon-γ gene were constructed.Total RNA of chicken spleen cells was extracted aseptically.ChIL-18 and ChIFN-γ gene fragments were amplified by RT-PCR method，then cloned into pMDTM18-T and constructed recombinant plasmid pMDTM18-T-ChIL-18 and pMDTM18-T-ChIFN-γ.Fused gene of ChIL-18-ChIFN-γ was obtained by peptide amino acid linker，overlap technology was used to recombinant plasmid pMDTM18-T-ChIL-18 and pMDTM18-T-ChIFN-γ as template.，ChIL-18-ChIFN-γ were clonedinto pMDTM18-T vector and were identified by PCR，digestion and sequencing.Positive plasmid was digested by restriction endonuclease and fused gene was inserted into pET32aprokaryotic expression vector.The prokaryotic expression vector of ChIL-18-ChIFN-γ was successfully constructed.It laid the foundation for studying the role of their relationship and the antiviral function.

Chicken Interleukin 18；chicken interferon gamma；overlap；fused expression vector

S85；S83

A

1002-2090（2017）01-0049-05

2015-12-10

黑龙江农垦总局攻关项目（HNK125A-11-05）。

李晓婷（1991-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2014级硕士研究生。

崔玉东，男，教授，博士研究生导师，E-mail：cuiyudong@yahoo.com。