凝结芽孢杆菌增殖条件及抗性的研究

姚勇芳，廖延智，陈玉锋，谭才邓，邝哲师

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广东 广州 510300；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610）

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）又称为芽孢乳酸菌，属于硬（或厚）壁菌门肠道乳酸菌，是一类革兰氏阳性、兼性厌氧、可产芽孢的特殊乳酸菌。胞体呈杆状，两端钝圆，单个、成对、少数呈短链状，芽孢端生，无鞭毛，最适生长温度为 37～45℃，最适 pH 为 6.0～7.0［1-2］。1992年该菌种被美国食品与药物管理局（FDA）和美国饲料控制官员协会列入可用于饲料的安全菌株名单中［3］。

凝结芽孢杆菌芽孢体可以很好的耐受胃酸以及高胆盐环境到达肠道中复苏，在肠道中消耗大量的游离氧进行生长繁殖，对厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长起到促进作用，从而调节肠道内微生态的菌群平衡，提高机体免疫和抗病能力，减少肠道疾病的发生［4-5］。 除了具有传统乳酸菌可调节动物肠道健康、提高消化能力和提高免疫力等作用外，其芽孢状态对环境具有相当的抗逆性，对高温、胃酸和胆盐都有一定的耐受能力［5-6］。

凝结芽孢杆菌制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，又因其具有芽孢杆菌的丰富的酶系统及抗逆性强、耐高温高压、稳定的储存特性而被广大人们所青睐［7-9］。本试验通过凝结芽孢杆菌培养条件和培养基成分的优化以及抗性研究，以期获得高密度菌液，为在生物饲料中的应用累积理论数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 种子液的制备 挑取凝结芽孢杆菌（广东轻工职业技术学院食检教研室提供）斜面菌种1环，接种至LB基础培养基中，37℃、180 r/min摇床培养4～6 h，制得种子液。

1.1.2 培养基 LB基础培养基：酵母粉25 g/L，氯化钠10 g/L，蛋白胨10 g/L，加水至100 mL，自然pH值，121℃，15 min高压灭菌，备用。

LB改良培养基：酵母粉25 g/L，氯化钠2 g/L，蛋白胨5 g/L，加水至100 mL，pH 7.4，121℃，15 min高压灭菌，备用。

MRS培养基：取6.43 gMRS培养基于100 mL蒸馏水中，自然pH值，121℃，15 min高压灭菌，备用。

1.1.3 试剂 氯化钠、葡萄糖、硫酸锰、硫酸镁、淀粉、麦芽糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸，以上试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器 YX-280D压力蒸汽灭菌锅，合肥华泰医疗设备有限公司；JJ500A电子天平，苏州常熟测试仪器厂；SW-CJ-2D超净工作台，苏州净化设备有限公司；HPX-9162MBE数显电热培养箱，上海楚柏实验室设备有限公司；SPH-200数显恒温摇床，天津市欧诺设备仪表有限公司；TopPette移液枪，深圳市科力易翔仪器设备有限公司；DK-826电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 凝结芽孢杆增殖条件研究 （1）凝结芽孢杆菌培养条件：将1%种子液接种至100 mL的LB基础培养基中，转速180 r/min，37℃培养。每隔2 h取菌液测定560 nm波长下的吸光度，0 h为对照，绘制24 h的生长曲线。得出最适生长时间后，分别测定最适的培养温度、转速以及初始pH值，见表1。

表1 培养温度、转速、初始pH值对凝结芽孢杆菌生长影响的研究

（2）凝结芽孢杆菌生长培养基成分优化：分别改变LB基础培养基中氯化钠、蛋白胨及酵母粉含量，其他条件同“（1）凝结芽孢杆菌培养条件”，见表2。对凝结芽孢杆菌生长的LB基础培养基进行改良。

表2 LB基础培养基的改良对凝结芽孢杆菌生长影响的研究（g/L）

在上述改良LB基础培养基中分别添加葡萄糖 0、2、5、8、10 g/L，麦芽糖 0、2、5、8、10 g/L，淀粉 0、2、5、8、10 g/L，其他条件同“（1）凝结芽孢杆菌培养条件”，研究糖类添加物对凝结芽孢杆菌生长的影响。在改良LB基础培养基中分别添加0∶10、3∶5、5∶8、8∶2、10∶0磷酸氢二纳（g/L）和磷酸二氢钠（g/L）之比，其他条件同“（1）凝结芽孢杆菌培养条件”，研究磷酸盐添加物对凝结芽孢杆菌生长的影响。在改良LB基础培养基中分别添加七水硫酸镁 0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4，硫酸锰0、0.2、0.5、0.8 g/L，硫酸铵0、2、4、6、8 g/L，其他条件同“（1）凝结芽孢杆菌培养条件”，研究硫酸盐添加物对凝结芽孢杆菌生长的影响。在单因素考察的基础上，选取麦芽糖、磷酸氢二纳：磷酸二氢钠、硫酸锰和硫酸镁4个因素，设计4因素3水平正交试验，见表3。进行LB改良养基添加成分优化的正交试验。

表3 凝结芽孢杆菌培养基优化因素水平

1.2.2 凝结芽孢杆菌抗性研究 （1）凝结芽孢杆菌耐热性：在3瓶50 mL的LB基础培养基中分别加入“1.2.1”所得菌悬液5 mL，分别置于温度为80、90、100℃的水浴锅中保温5、10、15、20、25 min，同时0 min作为对照；移取1 mL迅速冷却，测定活菌数，计算D值和Z值，研究热力致死时间曲线方程。

（2）凝结芽孢杆菌耐肠道环境：5瓶50 mL的LB基础培养基pH 分别调至为2、3、4、5、6，加入“1.2.1”所得菌悬液5 mL，37℃，180 r/min的摇床中作用 3 h，同时0 h为对照。移取1 mL迅速冷却，测定活菌数，按照以下公式计算存活率∶存活率=对照凝结芽孢杆菌菌落总数/作用3 h凝结芽孢杆菌菌落总数×100%。

5瓶50 mL的LB基础培养基中分别加入0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4% 的猪胆盐，加入“1.2.1”所得菌悬液5 mL，37℃，180 r/min的摇床中作用 4 h，同时0 h 为对照；移取1 mL迅速冷却，测定活菌数，并计算存活率。

1.2.3 测定方法 凝结芽孢杆菌数的测定方法按GB 4789.35-2016《 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》。

2 结果与分析

2.1 凝结芽孢杆菌增殖条件研究

图1 凝结芽孢杆菌生长曲线的研究

2.1.1 凝结芽孢杆菌培养条件 由图1～图4可知，依据不同培养时间计数结果，绘制凝结芽孢杆菌生长曲线所示。培养0～20 h，经过很短的延滞期后，进入对数生长期，菌落总数的增长幅度较大，培养20 h活菌数OD值达到2.361。培养20 h后吸光度稳定，活细菌数保持相对稳定，所以选取20 h为最佳培养时间。31～40℃之间，温度对凝结芽孢杆菌生长影响不大，液体菌密度在108数量级以上，37℃相对较高。凝结芽孢杆菌的总数随着摇床转速的增加而增加，当转速为180～220 r/min时总数达到109数量级，考虑到设备能耗，选择180 r/min为最适转速。随着初始pH的增大，凝结芽孢杆菌数不断增加。初始培养基为中性偏碱性环境促进凝结芽孢杆菌生长。初始pH=7.4时的菌落总数达到最大9.4×109CFU/mL。凝结芽孢杆菌培养基生长过程中，持续产生乳酸，造成培养基pH值逐渐下降，初始培养基酸性越大，越不适应凝结芽孢杆菌的生长。

图2 培养温度对凝结芽孢杆菌生长的影响

图3 转速对凝结芽孢杆菌生长的影响

图4 初始pH值对凝结芽孢杆菌生长的影响

2.1.2 凝结芽孢杆菌生长培养基成分优化 （1）凝结芽孢杆菌生长LB基础培养基的改良LB基础培养基的改良对凝结芽孢杆菌生长影响见图5～图7。图5显示，添加氯化钠含量2g/L时凝结芽孢杆菌菌密度达到1.0×1010CFU/mL。图6显示，凝结芽孢杆菌总数5g/L时达到最大值2.4×1010CFU/mL。蛋白胨含量在0～20 g/L范围时，培养菌液pH值维持在7.4～6.9之间，蛋白胨是由酸、碱或蛋白酶水解蛋白质的不完全水解产物，是含䏡、胨、肽和氨基酸等的有机混合物。 图7显汞，酵母粉含量为0～30 g/L时，随着酵母粉含量逐渐增加，培养液pH逐渐下降至中性范围，有利酸性环境及充足的C源及微量元素，凝结芽孢杆菌在25g/L时菌密度达到最大。

图5 氯化钠含量对凝结芽孢杆菌生长的影响

图6 蛋白胨含量对凝结芽孢杆菌生长的影响

图7 酵母粉含量对凝结芽孢杆菌生长的影响

（2）改良LB基础培养基添加物质对凝结芽孢杆菌生长的影响：改良LB基础培养基添加物质对凝结芽孢杆菌生长的影响见图8～图12。如图8所示，添加葡萄糖含量在2g/L时，菌密度达到最大值8.4×1010CFU/mL；添加麦芽糖含量在8.0 g/L时，菌密度达到最大值1.36×1011CFU/mL；添加淀粉含量10.0 g/L时菌密度达到8.4×1010CFU/mL，并呈上升趋势。从凝结芽孢杆菌高殖化培养的影响效果上看，影响效果麦芽糖＞淀粉＞葡萄糖。由图9可知，磷酸氢二纳添加量为3 g/L、磷酸二氢钠添加量为5g/L时凝结芽孢杆菌数达到8×10 CFU/mL。磷酸氢二钠水溶液显弱碱性，其水解产物HPO4-，具有还原性，并且较高浓度时具有一定抑菌作用，因此磷酸氢二纳∶磷酸二氢钠为0g/L∶10g/L、3g/L∶5g/L、5g/L∶8 g/L 较为合适，数量达到1010数量级。如图10～图12所示，硫酸镁添加量为1.0 g/L时，菌密度达到最大，8.8×1010CFU/mL；硫酸锰添加量为0.2 g/L时，菌密度达到最大，为9.0×1010CFU/mL；硫酸铵添加量为0 g/L时，菌密度达到最大，为3.6×1010CFU/mL。

凝结芽孢杆菌的LB改良养基添加成分正交试验结果见表4。

图8 不同糖类对凝结芽孢杆菌生长的影响

图9 磷酸盐对凝结芽孢杆菌生长的影响

图10 硫酸镁含量对凝结芽孢杆菌生长的影响

图11 硫酸锰含量对凝结芽孢杆菌生长的影响

图12 硫酸铵含量对凝结芽孢杆菌生长的影响

表4 凝结芽孢杆菌高殖化培养基成分的优化试验设计方案L9（34）

由表4极差R大小可知，影响因素主次为：B＞D＞C＞A；对表4结果进行分析优化组合为：A1B3C3D3，即麦芽糖6 g/L、磷酸氢二纳∶磷酸二氢钠之比 5∶8、硫酸镁1.2 g/L、硫酸锰0.3 g/L。根据表2正交试验结果配制正交结果最优培养基，对凝结芽孢杆菌进行培养验证，结果凝结芽孢杆菌在100 mL摇瓶中培养后的菌落总数达到3.8×1011CFU/mL。

2.2 凝结芽孢杆菌抗性研究

图13 凝结芽孢杆菌耐热性研究

2.2.1 凝结芽孢杆菌耐热性 以保温时间为横坐标，存活率为纵坐标，作出凝结芽孢杆菌耐热曲线，结果见图13。以加热温度为横坐标，D值为纵坐标，作出凝结芽孢杆菌的热力致死曲线，结果见图14。

由图13、图14可知，D80℃= 82.24 min，R280℃= 0.9943，D90℃=4 7.92 min，R290℃= 0.9955，D100℃= 16.92 min，R2100℃= 0.9944，凝结芽孢杆菌的热力致死曲线方程为y=- 3.266x+ 342.96。

2.2.2 凝结芽孢杆菌耐肠道环境优化 由表5可知，凝结芽孢杆菌在pH值为2～6时环境中均可正常生长，在pH为2～6的强酸环境中存活率都可达到100%以上，耐受性良好。凝结芽孢杆菌在猪胆盐浓度为0.2%～1.4%之间均可正常生长，且存活率均可达到100%以上。

图14 凝结芽孢杆菌热力致死曲线

表5 凝结芽孢杆菌耐肠道环境的研究

3 结论与讨论

（1）通过培养基配方及培养条件的研究，得出凝结芽孢杆菌最适增殖条件为：最佳培养基配方：氯化钠：2 g/L，蛋白胨：5 g/L，酵母粉：25 g/L，麦芽糖6 g/L，磷酸氢二纳（g/L）∶磷酸二氢钠（g/L）之比5∶8，硫酸镁1.2 g/L，硫酸锰0.3 g/L，初始pH值：7.4，转速180 r/min，37℃培养20 h，菌落总数可达到3.8×1011CFU/mL。

凝结芽孢杆菌生长周期进入衰亡期不明显，可能是后期形成芽孢对环境有较强的抗逆性。通过改变摇床转速而改变培养基瓶内的通氧量，凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在一定范围内，摇床转速越大，不断提高培养基内溶氧水平，能够大量繁殖，超过180 r/min，溶氧达到饱和状态。

氯化钠含量对有效菌体维持内外渗透压平衡，同时有效提供 Na+、Cl-［10］，钠含量的增加，导致菌体脱水同时溶氧量下降，产酸能力加强，pH降低，不适应微生物数量增长［11］；蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类，是作为微生物培养基的主要原料之一，是一种两性电介质，具有一定的缓冲作用，易溶于水，便于细菌生长繁殖。 当蛋白胨含量过高时，培养基中含氮化合物，造成C∶N比失调，不利于凝结芽孢杆菌的生长繁殖［12-14］。

当培养基中葡萄糖含量较高时，凝结芽孢杆菌能快速利用单糖，被用于乳酸发酵产生L-乳酸，使pH值快速降低，反而抑制了凝结芽孢杆菌的代谢生长。麦芽糖、淀粉同样浓度条件下，通过凝结芽孢杆菌分泌的а-淀粉酶等胞外酶，分解形成更多有效的C源物质，促进菌体合成代谢，利于生长。但当淀粉浓度过高时，培养基呈粘稠度较高的糊状，不利于培养基溶氧，不适合凝结芽孢杆菌的生长［15-16］。

培养基中添加磷酸盐既可以为细菌的生长繁殖提供必要的磷元素，构成核酸、磷脂、许多辅酶或辅基、各种磷酸腺苷（ADP、ATP等）、磷酸维生素B2等［17］；同时也可以利用磷酸盐对溶液的酸碱度维持作用使培养基pH值稳定，以期能进一步促进凝结芽孢杆菌的生长繁殖。

微生物从外界环境中以硫酸根离子态吸收硫，用于自身生长代谢，通过添加金属硫酸盐，既可以向培养基中添加硫元素，又可以添加必要的金属元素。镁元素是许多酶的活化剂，能促进碳水化合物的新陈代谢、核酸的合成等。锰离子是一些生化反应的催化剂，并且硫酸锰可以促进芽孢杆菌产芽孢，添加过量造成菌体蛋白质变性，抑制菌体生长。凝结芽孢杆菌不能利用铵盐作为氮源，同时铵盐对凝结芽孢杆菌胞外酶的合成有较强抑制作用［18-19］。

（2）通过对凝结芽孢杆菌菌液耐热性、耐酸性以及耐胆盐性的研究，得出凝结芽孢杆菌D80℃= 82.24 min，R80℃2= 0.9943，D90℃= 47.92 min，R90℃2= 0.9955，D100℃= 16.92 min，R100℃2= 0.9944，热力致死曲线方程为y= -3.266x+ 342.96。饲料的制粒温度一般为70～90℃，在调制器和制粒机内总的时间为25～30 s。计凝结芽孢杆菌分别在80、90℃热接触30 s时，存活率分别为100%和95.21%。

在pH值为2～6中，存活率均超过100%。pH主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性及营养物质离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收。益生菌需要进入动物须经过胃酸环境（pH范围为2.6～5.83） 才能到达肠胃发挥作用。

并且对猪胆盐也有具有良好的耐受性，在0.2% -1.4%的猪胆盐溶液中存活率超过100%。芽孢杆菌在动物胃肠道存活和增殖的另一道屏障就是需要经受住小肠液对菌体的破坏作用。十二指肠中的胆汁酸盐对外源细菌具有抑制作用，菌体只有具备较高的胆盐耐受性，才能保持足够的活菌数，从而发挥益生作用［20-21］。

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