Ubc9在胃癌中的表达及其与耐药蛋白的相关性研究

(太原市第九人民医院，山西 太原 030008)

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤，根据全球癌症研究机构的数据统计，胃癌位于全球恶性肿瘤发病的第五位，死亡率位于第三位。我国是胃癌高发国家，发病率和死亡率分别占到全球的42.6%和45.0%[1]。泛素结合酶9(Ubiquitin-conjugating enzyme 9,Ubc9)是小泛素相关修饰物(small ubiquitin related modifier，SUMO)过程中唯一的结合酶，Ubc9在细胞增殖、有丝分裂、周期进程、分化等方面发挥着重要作用[2]，最近的研究表明，Ubc9在多种肿瘤中过表达，可能参与了肿瘤发生、进展的病理过程，并且可能与肿瘤的耐药相关[3]，本研究观察了Ubc9及耐药相关蛋白P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)在胃癌中的表达及相关性，现报告如下。

1 实验方法

1.1 一般资料

收集太原市第九人民医院普通外科2016年4月～2017年4月入院手术切除的胃癌组织及相应癌旁组织(距离肿物>5 cm)标本40例，标本收集以不影响术后病理诊断为前提，所有标本经术后病理诊断为胃腺癌。纳入研究的患者术前均未经任何形式的放化疗及靶向治疗，均为散发病例，无家族史。其中：男27例，女13例，年龄42～71岁，中位年龄55.7岁；肿物≤5 cm者25例，>5 cm者15例；高分化10例，中低分化30例；有淋巴结转移者19例，无淋巴结转移者21例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ者26例，Ⅲ+Ⅳ者14例。

1.2 试剂及仪器

试剂：Ubc9单克隆抗体：Santa-cruz(sc-130281)；MRP单克隆抗体：北京中杉金桥(ZM-0345)；P-gp多克隆抗体：北京博奥森(bs-0563R)；生物素标记的IgG二抗：北京中杉金桥。仪器：石蜡切片机、摊片烤片机：德国Leica；全自动脱水机：美国Thermo Fisher。

1.3 免疫组织化学SP法检测Ubc9, MRP及P-gp在胃癌组织及癌旁组织中的表达

收集的组织标本立即置于中性福尔马林液中固定24 h，全自动脱水机脱水、包埋至蜡块；常规石蜡切片，厚度5μm，多聚赖氨酸处理的载玻片捞片，烤片机烤片5h；枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，阻断内源性生物素及过氧化物酶，血清封闭；滴加一抗，4℃过夜反应，以PBS代替一抗作为阴性对照；滴加二抗，37℃反应30 min；DAB显色，蒸馏水终止显色；苏木精复染细胞核，封片裱片。 免疫组化结果判定方法：Ubc9蛋白的阳性信号定位于细胞质或/和细胞核，以染色强度(-为0分，+为1分，++为2分，+++为3分)和阳性细胞百分比(<5%为0分; 5%～24%为1分; 25%～49%为2分; 50%～74%为3分;>75%为4分)的乘积进行评分，评分<6分为低表达，≥6分为高表达。MRP及P-gp蛋白的阳性信号定位于细胞膜或/和细胞浆，阳性细胞数<10%为阴性表达，≥10%为阳性表达。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料采用χ2检验，相关性分析采用计数资料的关联性分析，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 Ubc9、MRP及P-gp在胃癌组织及癌旁组织中的表达

Ubc9、MRP及P-gp在胃癌组织中的高表达/阳性表达率依次为：62.5%,32.5%及72.5%，在癌旁组织中的高表达/阳性表达率依次为：15.0%, 10.0%及22.5%，与癌旁组织相比，三者在癌组织中的表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 Ubc9,MRP及P-gp在胃癌组织及癌旁组织中的表达

图1 Ubc9,MRP及P-gp在胃癌组织及癌旁组织中的表达

IHC×200

(A:Ubc9在癌旁组织中低表达，B：Ubc9在癌组织中高表达；C:P-gp在癌旁组织中阴性表达， D：P-gp在癌组织中阳性表达；E:MRP在癌旁组织中阴性表达，B：MRP在癌组织中阳性表达)

2.2 Ubc9,MRP及P-gp在胃癌组织中的表达与临床病理特征的关系

Ubc9的表达与患者的性别、年龄、肿物大小及淋巴结转移无明显关系(P>0.05)，与肿瘤的分化程度及TNM分期有关(P<0.05)；MRP的表达与患者的性别、年龄、肿物大小、分化程度、淋巴结转移及TNM分期无明显关系(P>0.05)；P-gp的表达与患者的性别、年龄、肿物大小无明显关系(P>0.05)，与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05)。见表2。

表1 Ubc9,MRP及P-gp在胃癌组织中的表达与临床病理特征的关系 例

2.3 Ubc9的表达与MRP及P-gp表达的相关性

胃癌组织中，Ubc9的表达与MRP的表达无显著相关性(P>0.05)，与P-gp的表达呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 Ubc9的表达与MRP及P-gp表达的相关性

3 讨论

SUMO化修饰可参与基因转录、调节、细胞信号转导等多种途径，是蛋白质翻译后修饰的重要机制之一，不恰当的SUMO化修饰是多种疾病，尤其是肿瘤发生发展中的重要分子生物事件[4]。Ubc9基因于1996年首次通过酵母杂交实验被克隆，1997年被确定为SUMO化修饰过程中的唯一结合酶，在人类器官组织中普遍表达，在睾丸、胸腺等组织中高表达[5]。Ubc9参与的SUMO化过程与肿瘤密切相关，目前的研究结果显示：Ubc9在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中过表达，通过RNA干扰等方式下调Ubc9基因的表达可抑制肿瘤细胞增殖[6]。Chen等[7]学者的研究结果显示乳腺浸润性导管癌中Ubc9的高表达提示预后不良，并且临床化疗反应性差，Fang等[8]的研究表明下调Ubc9基因的表达可增加肝癌细胞对多柔比星的化疗敏感性，提示Ubc9还可能与肿瘤的多药耐药相关。P-gp及MRP介导的多药耐药是目前研究最为深入的肿瘤耐药机制之一，包括胃癌在内的多种实体瘤的多药耐药与其密切相关。P-gp主要介导多种亲脂性化疗药物，包括抗生素类如多柔比星、长春新碱、依托泊苷等。MRP识别和转运与谷胱甘肽耦合的药物，如柔红霉素、顺铂等[9]。本研究初步观察Ubc9、P-gp及MRP在胃癌中的表达及相关性，为胃癌的研究提供新的思路。

本实验结果表明：Ubc9在胃癌及癌旁组织中均有不同程度的表达，但在癌组织中的高表达率显著高于癌旁组织，提示Ubc9可能参与了胃癌发生发展的病理过程。此外，Ubc9与患者年龄、性别、肿物大小、淋巴结转移无明显相关，但在中低分化胃癌中的高表达率显著高于高分化癌，在TNM分期Ⅲ+Ⅳ中的高表达率显著高于Ⅰ+Ⅱ，说明Ubc9的表达可能与胃癌的恶性程度及预后相关。P-gp及MRP均属于ABC跨膜转运蛋白超家族成员，虽然二者的分子构成及具体作用机制不同，但相似的作用结果是可将药物泵出细胞外，降低药物在细胞内的浓度，从而导致细胞耐药。本研究结果表明：P-gp及MRP在胃癌中的表达显著高于癌旁组织，MRP的表达与患者的性别、年龄、肿物大小、分化程度、淋巴结转移及TNM分期均无明显关系，P-gp的表达与患者的性别、年龄、肿物大小无明显关系，与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关。相关性分析结果显示：Ubc9的表达与MRP的表达无显著相关性，与P-gp的表达呈正相关。上述结果提示Ubc9可能参与了P-gp介导的多药耐药过程。

综上，Ubc9可能参与了胃癌的发生、进展的病理过程，并且可能与P-gp介导的耐药过程相关，其具体的机制尚待进一步研究。值得注意的是：Ubc9参与的SUMO化过程具有相对可逆性，相信随着研究的深入，该途径有望成为肿瘤治疗的基因和药物靶点。

[1] Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer Incidence and Mortality Worldwide:Sources,Methods and Major Patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359-386.

[2] Spektor TM，Congdon LM，Veerappan CS，et al．The Ubc9 E2 SUMO Conjugating Enzyme Binds the PR-Set7 Histone Methyltransferase to Facilitate Target Gene Repression．PLoS ONE．2011，6(7)： 22785．

[3] Mo YY,Moschos SJ.Targeting Ubc9 for Cancer Therapy[J].Expert Opin Ther Targets,2005,9(6):1203-16.

[4] Lee JS,Choi HJ,Baek SH.Sumoylation and Its Contribution to Cancer[J].Adv Exp Med Biol，2017,963:283-298.

[5] Lomeli H，Vazquez M．Emerging Roles of the Sumo Pathway in Development[J]．Cell Mol Life Sci,2011,68(24)：4045,4064．

[6] Xu J,Footman A,Qin Y,et al.BRCA1 Mutation Leads to Deregulated Ubc9 Levels which Triggers Proliferation and Migration of Patient-Derived High Grade Serous Ovarian Cancer and Triple Negative Breast Cancer Cells[J].Int J Chronic Dis Ther,2016,2(3):31-38.

[7] Chen SF,Gong C,Luo M,et al.Ubc9 Expression Predicts Chemoresistance in Breast Cancer[J].Chin J Cancer,2011,30(9):638-44.

[8] Fang S,Qiu J,Wu Z,et al.Down-regulation of UBC9 Increases the Sensitivity of Hepatocellular Carcinoma to Doxorubicin[J].Oncotarget,2017,8(30):49783-49795.

[9] Zhang YK,Wang YJ,Gupta P.Multidrug Resistance Proteins(MRPs) and Cancer Therapy[J].AAPS J,2015,17(4):802-12.