共聚焦激光显微内镜联合荧光靶向探针诊断消化道肿瘤及癌前病变的研究进展

贾逸文 综述 刘海峰 审校

共聚焦激光显微内镜联合荧光靶向探针诊断消化道肿瘤及癌前病变的研究进展

贾逸文 综述 刘海峰 审校

激光共聚焦内镜；分子影像；肿瘤；消化道

消化系统肿瘤是世界范围内最常见的肿瘤病变，严重危害人类健康；提高早期肿瘤的诊断水平对于提高患者生存率、减轻社会经济负担有着深远的意义[1,2]。目前国际研究表明，内镜检查是发现消化系统肿瘤的最有效途径。然而，现有内镜技术存在检出率低，漏诊率高等诸多问题。为解决这些问题，分子影像学为我们提供了新的思路[3]。荧光分子成像技术(fluorescence molecular imaging，FLI)可以在细胞和分子水平对活体内的生物过程进行研究，同时利用靶向探针与特定分子结合可实现实时、定量成像。随着分子靶向探针技术的发展，它已被广泛应用于细胞学、分子生物学、医学等众多领域[4-6]。该技术可与多种现代学科交叉，其应用的范围正在不断拓展，而与共聚焦激光显微内镜的联合应用引起了人们的关注。

1 荧光分子成像技术与共聚焦激光显微内镜

荧光分子成像技术是近些年出现的新兴分子影像技术。其成像原理是利用特异性的荧光分子探针标记特定的分子或细胞，从而得到这些物质的含量及分布情况，具有灵敏度高，特异度高，重复性好等优势，尤其适用于研究胃肠道的病理、生理分子机制[7]。

共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy，CLE)作为一种新内镜成像方式，已被广大内镜医生所认同，使临床医生能够在操作白光内镜的同时对胃肠道黏膜进行放大观察，对浅表病灶进行鉴别诊断，其放大倍数可以达到1000倍[8]。CLE通过静脉注射和表面喷洒非特异性的荧光对比剂进行荧光成像，实时观察消化道黏膜上皮细胞、腺体及血管等显微结构[9,10]。目前可在临床上使用的CLE设备有两种类型：一种是将共聚焦探头安装在传统白光内镜前端的整合式内镜(integrated confocal lasar endomicroscopy，iCLE)；另一种是将微探头通过白光内镜的活检孔道递送的探头式内镜(probe-based confocal lasar endomicroscopy，pCLE)[11,12]。CLE是把形态学和组织学相联合的新型诊断工具，能清楚地显示亚细胞结构，以达到“光学活检”的目的。但是由于常规使用的荧光染料如荧光素钠、盐酸吖啶黄、四环素、甲酚紫均为非特异性染料，这些染料用于对比剂，只能对组织进行大致的观察发现问题，无法特异性地发现病变组织(如不典型增生，上皮内瘤变或者恶性肿瘤等)进行有针对性的观察。目前研究表明将荧光靶向探针和共聚焦激光显微内镜技术相结合可以特异性地发现病变，并能对病灶进行实时免疫组化(immunohistochemistry，IHC)[13-15]，达到对可疑病变快速而准确诊断的目的，对此国内外已经开展了相关研究。

2 对消化道疾病的诊断应用

近年来，CLE将消化道病变的内镜诊断和病理组织学诊断有效地结合起来, 通过对比病灶和正常组织的图像特征，进而诊断疾病，在将来有望取代耗时费力的传统组织病理切片技术。

2.1 食管肿瘤及癌前病变 最新研究数据表明，近年来西方人群中食管腺癌 (EAC)的发病率显著增加，且其预后不良，早期发现食管癌及癌前病变是改善预后的关键[16,17]。利用CLE联合荧光靶向探针可以发现食管表面发生异型增生的黏膜。2013年Sturm等[18]应用噬菌体表面展示肽库技术，筛选出能与食管异性增生黏膜特异性结合的短肽ASYNYDA，在可疑病变表面喷洒FITC标记短肽ASYNYDA ，对25个Barrett食管病人进行pCLE成像来检测Barrett食管的异型增生，其敏感度和特异度分别能达到75%和97%。这是第一次证明了应用荧光标记的特异性短肽可以对人食管下端黏膜进行CLE成像，并可以在体诊断Barrett食管的异型增生，整个成像过程可在5 min内完成，在日常临床诊疗中具有较高可行性。

人类表皮生长因子受体2(HER2)广泛参与人类肿瘤的恶性进程，其中也包括EAC。通过对HER2受体进行靶向荧光成像对发现食管癌有良好效果。2015年S. Realdon等[19]通过研究证明，在外科诱导食管癌小鼠体内，食管癌组织中HER2信号的表达远高于正常组织和Barrett食管组织。而后应用AlexaFluor488标记的抗HER2抗体，通过尾静脉注射入4只经外科诱导80周后的小鼠(其中3只病理证实为食管腺癌，1只为Barrett食管)体内，并使用探头式CLE(pCLE)进行成像。结果显示其中3只食管腺癌小鼠HER2过度表达，而在小鼠的正常组织和Barrett食管组织中并没有观察到信号。实验证实HER2过度表达是食管腺癌的特征性表现，应用CLE可以对食管腺癌小动物模型进行在体诊断，并且通过量化荧光信号的方法，可以指导活检，提高了常规病理活检操作的特异性。

2.2 胃肿瘤 胃癌是世界第2大肿瘤死亡相关疾病，每年有超过100万人被诊断为新发胃癌[20]。早期诊断并治疗可以显著提高胃癌病人的生存率。早期胃癌的发生发展往往伴随着某些细胞受体或成分的表达异常。表皮生长因子受体(EGFR)是表皮生长因子(EGF)进行信号传导的受体，与肿瘤细胞的增殖分化、血管生成、侵袭转移及细胞凋亡的抑制有关。研究表明在很多肿瘤组织中存在EGFR的高表达或表达异常。存活素(Survivin)是一种新近发现的分子量16.5 ku细胞内蛋白,属于抗细胞凋亡蛋白家族，可以广泛的抑制细胞凋亡，并促进有丝分裂。通过对组织表面的EGFR和Survivin的观察可以发现胃癌病变。2012年Nakai Y等[21]通过表面喷洒及黏膜注射两种方式，将FITC标记EGFR抗体及Survivin抗体注入正常猪食管和胃黏膜，并利用pCLE进行了靶向分子成像。研究表明通过CLE能够观察到猪的食管和胃黏膜存在EGFR和Survivin表达，结果由体外免疫组化所证实。在食管中EGFR和Survivin主要在局部角化的祖细胞中表达。而在胃中，EGFR主要在局部祖细胞区及上皮细胞表达，Survivin则表现出相似的结果，但在上皮细胞表达率更高。研究证明了通过FITC标记EGFR抗体及Survivin抗体对正常食管和胃黏膜进行在体成像的可行性，同时也为更好地了解胃肠道的病理生理学提供了一项新的方法。

用荧光标记的EGFR抗体探针检测肿瘤组织，可筛选出EGFR过表达的患者，对这些患者进行靶向治疗，可获得较好疗效。2012年，Hoetker MS等[22]利用FITC标记EGFR抗体(诊断性探针)，使用Optiscan FIVE1系统对胃癌移植瘤小鼠模型进行共聚焦成像，观察结果得出，瘤体表面的信号强度明显高于周围的结缔组织(P=0.0145)。同时又应用AlexaFluor488标记的西妥昔单克隆抗体进行成像，得到相似的结果(P=0.047)。该研究初步探讨了靶向治疗药物用于分子成像的可行性，为分子靶向药物疗效早期预测提供了理论依据及技术支持，实现了诊断与治疗同时进行，并有望成为未来个体化治疗的参考标准。2013年，Li Z等[23]使用AlexaFluor488标记MG7抗体对23例人类胃癌标本进行了共聚焦成像。胃癌相关特异性抗原MG7-Ag是一种国内学者新发现的诊断标志物，在胃癌组织中高表达，而在正常胃黏膜组织不表达[24]。利用MG7抗体对相关抗原进行检测，可以特异性的发现胃癌细胞。实验结果表明，该方法可以鉴别胃癌组织与正常黏膜(P<0.001)，协助提高胃癌检出率，并且可以筛选出MG7抗体阳性患者作为靶向治疗的敏感患者，提高治疗反应性。

2.3 结直肠肿瘤及癌前病变 结直肠癌(CRC)的发生发展是一个多步骤的过程，与基因的改变和环境因素相关。大部分的CRC可以通过检查和切除息肉性病变来预防。尽管内镜技术已取得了较大提升，但结肠癌的发病率依然很高，原因主要是由于常规内镜检查只能发现黏膜形态学上的改变，而缺乏分子特异性。如能对结直肠癌的癌前病变进行分子成像，可以在病变形态学改变之前发现病变，实现病变早期诊断的目的。2007年，Hsiung PL等[25]利用噬菌体表面展示肽库技术，合成短肽VRPMPLQ作为靶向探针，并可以与人类结直肠腺癌细胞特异性结合。相对于抗体式的靶向探针，短肽探针具有抗原性低，无毒，结构简单，易于制备等多种优势。通过肠道表面喷洒共轭荧光素钠标记的短肽VRPMPLQ，对结直肠腺瘤26例进行了内镜检查和pCLE成像，并对标本进行病理学检查。通过比较病变部位荧光强度及隐窝形态，检出结直肠组织上皮内瘤变的敏感性为81%，特异性为82%(α< 0.01)。实验验证了应用短肽分子成像诊断肠道上皮内瘤变的可行性，并评估肿瘤发展过程中的恶性程度，及检测肿瘤进展中的生物标记物水平，为诊断结直肠癌前病变提供了新思路。

利用CLE技术可以对结肠癌组织进行特异性成像，使在体诊断结肠癌成为可能。2009年，Goetz M等[26]将FITC标记EGFR抗体分别注入高表达(SW480细胞系)和低表达(SW620细胞系)两类人结肠癌荷瘤鼠模型体内，采用Optiscan FIVE1共聚焦成像系统对肿瘤组织进行成像，首次实现了结直肠癌的在体分子成像，证实了CLE可以实时区别不同移植瘤细胞的EGFR表达差异。之后又选取8例患者的上皮内瘤变组织及非瘤变组织，以FITC标记EGFR抗体进行表面喷洒。CLE成像结果显示正常人类肠道黏膜和上皮内瘤变标本的平均荧光强度分别为0.25+/-0.16和2.12 +/-0.30，(P<0.002)，实验结果之间存在明显差异，为将来人类在体分子成像提供了理论支持。2013年，Liu J等[27]对37例结直肠肿瘤病人进行在体研究，对病变表面喷洒AlexaFluor488标记EGFR抗体，使用eCLE进行观察。其中在19例结直肠癌中有18例表现出特异性的荧光信号(94.7%)，18例结直肠腺瘤中有12例表现出特异性的荧光信号(66.7%)。而以上病人的正常组织均未观察到或只观察到极微量的特异性的荧光信号。所有观察部位均由体外免疫组化和病理所证实。实验表明体外结直肠癌组织免疫组化结果和体内EGFR分子成像结果具有良好的一致性，证明了人体在体CLE分子成像的可行性。

肿瘤的生长和转移离不开新生血管的形成。血管内皮生长因子(VEGF)是胃肠道肿瘤靶向治疗的靶点，在正常组织和肿瘤组织的血管生成中扮演重要角色。 CLE联合荧光靶向探针可以观察到VEGF受体在细胞膜上的分布。2010年Foersch S等[28]利用AlexaFluor488标记的血管内皮生长因子(VEGF)，对人结肠癌荷瘤鼠模型进行了CLE在体成像，同时又对结肠癌患者的肿瘤标本进行体外CLE成像。并将结果和病理，免疫组化及荧光显微镜结果进行比较。通过定量分析的方式分析图像结果，证明了应用此技术可以鉴别上皮内瘤变与正常黏膜(P<0.05)。研究表明CLE结合荧光靶向探针进行成像是一种有效区分肿瘤性和非肿瘤性病变的成像方式，可以早期发现肿瘤组织。研究发现运用治疗性靶向探针，可以筛选出药物敏感性高疗效好的患者，以实施个性化诊疗，将对结直肠癌及其癌前病变的诊断、治疗及预后评估具有重要意义。

综上所述，将荧光靶向探针和共聚焦激光显微内镜相结合，可对消化道肿瘤及癌前病变进行诊断，其与传统内镜相比，具有高特异性，高准确性，操作简单的优势，可早期诊断消化道肿瘤及癌前病变。同时运用靶向药物作为探针，可以实现个体化治疗，并预测治疗的反应性及对靶向治疗的效果，从而提高患者的远期生存率。然而，成像深度及表面喷洒穿透力有限，尚缺乏可供患者静脉应用的安全、无毒荧光标记分子探针等问题仍是目前急需解决重点。同时荧光信号强度判断标准尚需进一步统一和完善，对于采取半定量或者定量分析，业界还存在争议。但从目前的研究来看，这项技术仍体现出广阔的应用前景。未来随着技术的进步，分子影像学也必然会成为医生的得力助手，在日后的临床诊疗中发挥出巨大优势。

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(2016--收稿 2016--修回)

(责任编辑 梁秋野)

首都临床特色应用研究(2141109002514099)

贾逸文，硕士研究生。

100039 北京，武警总医院消化内科

刘海峰，E-mail:haifengliu333@163.com

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