40种中药材提取物对烟草黑胫病菌的抑制作用

芶*

（1.贵州省烟草公司遵义市公司，贵州 遵义 563000；2.中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点实验室，青岛 266101）

40种中药材提取物对烟草黑胫病菌的抑制作用

芶剑渝1,2，彭玉龙1，张长华1，夏艳2，孔凡玉2，张成省2*

（1.贵州省烟草公司遵义市公司，贵州 遵义 563000；2.中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点实验室，青岛 266101）

测定了崂山40种常见中药材提取液对烟草黑胫病菌的抑菌活性。结果表明，10 g/L乙醇提取物浓度下，有11种植物（占27.5%）提取物对烟草黑胫病菌抑制率达100%，有28种（占70%）抑菌率达80%以上。对公丁香提取液相对含量较高的4种组分的抑菌效果进行了进一步测定，结果表明，丁香酚和乙酸丁香酚酯10倍稀释液对黑胫病菌抑制率高，分别为100%和60.19%，说明丁香酚和乙酸丁香酚酯为公丁香的主要抑菌活性成分。本研究表明，公丁香提取物中活性成分丁香酚具有防治烟草黑胫病的良好应用潜力。

中药材；Phytophthora nicotiana；公丁香；抑菌活性

烟草黑胫病是危害我国烟草生产的重要病害，常年发病率为5%～12%，每年造成巨额经济损失[1]。目前生产上以化学防治为主，常用药剂主要有甲霜灵锰锌、霜霉威、烯酰吗啉等[2]。由于药剂品种相对单一，且使用年限较长，生产上已经出现了抗药性菌株[3-5]。此外，由于成熟期发病严重，施药防治易造成农药残留。因此，筛选和研究新的杀菌剂是一项非常迫切的工作。植物源杀菌剂被认为是化学合成杀菌剂最好的替代品，尤其是药用植物更具有开发为植物源杀菌剂的巨大潜力[6]。与化学农药相比，植物源农药具有低毒、无残留、选择性高及不易使病菌产生抗药性等优点而成为近年来研究与开发的热点领域[7]。有关植物源杀菌素对烟草黑胫病防治研究鲜有报道。王传吉等[8]报道了青蒿、苦参、蕲艾、广藿香、金银花等复配剂水提取物对黑胫病菌有良好的抑制作用，杨兰等[9]研究发现大蒜素500倍液对烟草黑胫病防治效果可达46.1%。本研究以青岛崂山40种常见中药材为试验材料，测定其对烟草主要黑胫病菌的体外抑菌活性，并进一步追踪抑菌作用强的药材的主要有效成分，为研发抗烟草主要病害的新型植物源杀菌剂提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料：40种青岛崂山中药材名称见表1（购买自北京同仁堂青岛分店）。供试菌株：烟草黑胫病菌（P. nicotiana）由本实验室从烟田采集感染病株分离纯化获得。培养基：燕麦培养基[6]。原药：丁香酚、乙酸丁香酚酯、β-石竹烯和α-石竹烯（购买自Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 药材提取液的制备 参考林勇等[10]方法。将购买的40种植物阴干，进一步于50 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干，粉碎过0.425 mm筛。称取50.0 g植物干粉于500 mL三角瓶，加入95%乙醇300 mL微波萃取法（微波炉调至中火，90 s），过滤并收集提取液，再加入300 mL 95%乙醇冷浸5 d，过滤并收集提取液，再次加入 300 mL 95%乙醇，超声波（功率为600 W）提取1 h，过滤并收集提取液，合并提取液，在50 ℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至干，回收溶剂，所得浸膏用甲醇定容为质量浓度100 g/L的溶液，获药材提取液，置于4 ℃保存备用。

1.2.2 烟草黑胫病菌抑菌试验 采用生长速率法测定上述药材提取物对病原菌菌丝生长的抑制作用[11]。将药材提取液与燕麦培养基充分混和，配制成浓度为10 g/L的培养基平板，在超净工作台中将菌饼（用经消毒的9 mm的打孔器在培养好的黑胫病菌落边缘打取带菌培养基，即制成菌饼）移植到上述加入提取物的培养基中心处（一皿一个菌饼），将菌丝面向下接触培养基。以等量甲醇作对照。每个处理3次重复。25 ℃培养5 d后，用十字交叉法测量并记录菌落直径。菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径×100%。

1.2.3 药材提取液化学组分抑菌试验 参考本实验室对公丁香提取物组分的分析结果[10]，选取丁香提取物中相对含量较高的化学组分，购买其单品的原药，以甲醇稀释10倍，参照1.2.2中方法，分别测定不同化学组分对黑胫病菌的抑菌效果，每个处理设3次重复，对照加入等量甲醇。

表1 供试药材Table 1 Chinese herbal medicines tested in this study

2 结 果

2.1 烟草黑胫病抑菌试验

所测定的40种药材中有11种药材对黑胫病菌表现出强烈的抑菌效果，菌丝生长抑制率均为100%，分别为贯众、海州常山、白头翁、金银花、香附、丹参、虎杖、苍术、东北龙胆、徐长卿和公丁香（表2）。除板蓝根外，其他28种药材抑菌率均在80%以上，抑菌作用十分明显（表2）。

表2 40种药材提取液对烟草黑胫病菌的抑菌作用Table 2 Inhibition of the extracts of 40 kinds of Chinese herbal medicines againstP.nicotiana

2.2 公丁香提取液化学组分抑菌试验

根据本实验室前期研究结果[10]，公丁香提取液中相对含量较高的化学组分，分别为丁香酚、乙酸丁香酚酯、β-石竹烯、α-石竹烯。选取以上4种组分的原药进行黑胫病菌抑菌试验。结果表明，4种组分中丁香酚含量最高，抑菌效果也最明显，对黑胫病菌具有强烈的抑制作用，10倍稀释液对黑胫病菌的菌丝生长抑制率均为100%；乙酸丁香酚酯10倍稀释液对黑胫病菌的菌丝生长抑制率分别为60.19%；而β-石竹烯和α-石竹烯均无抑菌效果（表3）。

表3 公丁香4种化学组分对烟草黑胫病菌抑菌作用Table 3 Inhibition of four chemical components againstP. nicotiana

3 讨 论

本文选取 40种崂山中药材[12]测定其乙醇提取物对烟草黑胫病菌的抑制作用，结果表明，崂山具有丰富的杀菌植物资源。在10 g/L浓度下，对烟草黑胫病菌抑制率达 100%的植物有 11种（占比27.5%），抑菌率80%以上的植物有28种（占比70%），说明上述植物具有良好的防治烟草黑胫病的潜力。上述植物中，苦参、金银花和藿香曾被报道对烟草黑胫病菌有抑制活性[8]，其余植物对烟草黑胫病菌的抑制作用均为本研究首次报道。本实验室前期研究发现公丁香提取液对烟草青枯病菌具有良好的抑制作用，并采用GC-MS鉴定了其提取液中含有12个组分[10]。本研究测定的40种植物中公丁香提取液对烟草黑胫病菌的抑制率达到 100%，具有潜在的应用潜力。对公丁香提取液中含量较高的4种组分的抑菌作用测定表明，含量最高的丁香酚对烟草黑胫病菌的抑菌效果最好，说明公丁香为抑制黑胫病菌的主要活性成分。丁香酚在医学上主要用于解热镇痛、抗炎麻醉等[13]，近年来有关丁香酚应用于植物病害防治的报道越来越多。Bai等[14]研究发现，丁香酚对烟草青枯病菌具有较强的抑制活性，能破坏菌体结构，降低病原菌代谢活性。丁香酚还用于植物病毒病的防治，比如烟草花叶病毒病[15]、番茄病毒病[16]等。本文研究表明，丁香酚对烟草黑胫病菌同样具有强烈的抑制作用。由于丁香酚在自然界中来源丰富，生产成本低，将其作为新型杀菌剂原料进行开发应用，前景十分光明。下一步应深入研究丁香酚抑菌作用机理，并开展田间试验，验证防病效果。

参考文献

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[8] 王传吉，王树声，赵阳，等. 一种植物源复配剂对烟草黑胫病的抑制及土壤特性的影响[J]. 中国烟草科学，2015，36（6）：83-87.

[9] 杨兰，袁谋志，田茂成，等. 大蒜素对烟草黑胫病防治效果的田间试验[J]. 湖南农业科学，2013（8）：24-25.

[10] 林勇，夏艳，徐茜，等. 崂山常见中药材提取物对烟草青枯病菌的抑制作用[J]. 中国生物防治学报，2016，32（2）：270-276.

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Inhibitory Activity of Forty Kinds of Chinese Herbal Medicines against Phytophthora nicotiana

GOU Jianyu1,2, PENG Yulong1, ZHANG Changhua1, XIA Yan2, KONG Fanyu2, ZHANG Chengsheng2*
(1. Zunyi Branch, Guizhou Tobacco Company, Zunyi, Guizhou 563000, China; 2. China Tobacco Integrated Pest Management of China Tobacco, Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China)

In this study, antifungal activities of ethanol extracts of 40 species of Chinese herbal medicines againstP. nicotianain vitrowere determined. The results showed that antifungal plant resources in Laoshan Mountain were rich. The inhibitive rates of eleven species (27.5%) reached 100% at the concentration of 10 g/L. 28 species had good inhibitive effects over 80% againstP. nicotiana. Determination of the antifungal activities of four fractions with relatively high content in the extracts of clove showed that 10-fold dilution of eugenol possesses the highest inhibitive rate (100%) againstP. nicotiana, while the inhibitive rate of eugenyl acetate was 60.19%. This study suggests that a big variety of plant species in Laoshan Mountain have antifungal activities, and the active ingredient eugenol of clove extracts has good potential as a biocontrol agent to control tobacco black shank disease.

Chinese herbal medicine;Phytophthora nicotiana; clove; antifungal activity

S435.72

1007-5119（2017）01-0064-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.011

中国农业科学院科技创新工程“滩涂生物资源保护利用”（ASTIP-TRIC07）；贵州省烟草公司遵义市公司“烟草真菌病害植物源杀菌素筛选与应用”（2016-09）

芶剑渝（1976-），男，硕士，研究方向：烟草生产技术。E-mail：goujianyuzy@126.com。*通信作者，E-mail：zhangchengsheng@caas.cn

2016-06-15

2016-09-12