仿生硅化固定化葡萄糖氧化酶与辣根过氧化酶研究

周 冉,宋玉品,刘晓妹,荀贺风,侯冬梅,吴欣蕊,刘玲君

(1.石家庄学院化工学院,河北石家庄 050035;2.河北工业大学化工学院,天津 300130;3.河北三元食品有限公司,河北石家庄 050000)

仿生硅化固定化葡萄糖氧化酶与辣根过氧化酶研究

周 冉1,宋玉品1,刘晓妹1,荀贺风1,侯冬梅1,吴欣蕊2,刘玲君3

(1.石家庄学院化工学院,河北石家庄 050035;2.河北工业大学化工学院,天津 300130;3.河北三元食品有限公司,河北石家庄 050000)

采用分步法将仿生硅化与脂质体技术相结合,模拟细胞微结构,以卵磷脂为原料,制备脂质体微囊,以胺类为诱导剂,在其表面硅化形成氧化硅壳层,实现对葡萄糖氧化酶(GOx)与辣根过氧化酶(HRP)双酶固定。研究了超声时间、诱导剂PDADMA用量、硅前驱体水解液(TMOS)用量、Triton X-100浓度等因素对固定化酶活性影响。结果表明,在200 μL PDADMA、0.7 mL TMOS、超声50 min制得的固定化酶活性最高,能迅速硅化形成直径200 nm左右的球形微囊。在此优化条件下制备的固定化酶经重复使用7次,依然达到初始催化酶活的61.46%,经一个月冷藏后酶活仍能达到最初的74.1%。可见,经过固定化,双酶系统的稳定性得到了显著提高。

仿生硅化,脂质体,葡萄糖氧化酶,辣根过氧化酶,纳米氧化硅微囊

含苯酚的废水是一种常见工业污染物,主要来源于石油化工、木材加工、造纸和制药等行业。残存在环境中的高浓度酚类物质会对人类及动植物产生极大的危害,是一种公认的致癌致畸物质。酶作为一种高效专一的生物催化剂,将其应用于环境污染物处理,正得到日益广泛重视与研究[1-2]。辣根过氧化物酶(HRP)能在较宽的温度和pH范围内催化芳香族化合物氧化生成酚氧自由基,这些自由基会进一步聚合生成溶解性较差的聚合物从溶液中沉淀出来。以往研究一般使用游离酶,但其本身存在易受废水中其他污染物影响和不能循环使用等缺点,限制了其在废水处理方面的应用,所以固定化酶的应用受到广泛的重视。

酶来源于生物体,在设计固定化酶载体时可借鉴酶在生物体中的存在环境。生物硅化过程反应条件温和,可在水环境、中性pH和较低的温度下(通常在生理条件下)进行[3-5]。通过仿生硅化制备有机质/氧化硅纳米复合物用作制备固定化酶的载体材料成为现在的研究热点[6-16]。近年来,研究人员将脂质体技术与仿生相结合,研究出有机/无机杂化固定化载体,以达到综合利用有机材料和无机材料的优点进行酶固定化的目的[17-25]。

应用HRP催化去除苯酚的过程为双底物反应,应保证存在原位H2O2参加整个反应。H2O2本身对酶有抑制作用且浓度不易控制。本研究将仿生硅化与脂质体技术相结合,模拟细胞微结构,探讨了以脂质体为模板固定化葡萄糖氧化酶(GOx)和HRP双酶的可行性。结合固定化双酶系统中包埋的GOx,加入葡萄糖作为底物产生原位H2O2,减弱了直接加入H2O2时对酶产生的抑制作用[23]。并优化反应条件,考察了超声时间、诱导剂PDADMA的用量、硅前驱体水解液(TMOS)用量、Triton X-100的浓度等条件的影响,以及固定化酶的重复使用性和储存稳定性。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

正硅酸甲酯(TMOS) 天津市化学试剂研究所;葡萄糖氧化酶>100 U/mg(GOx)、辣根过氧化物酶>150 U/mg(HRP) 上海源叶生物科技有限公司;聚二甲基二烯丙基铵[PDADMA(20 wt.% in H2O)] Sigma公司;4-氨基安替比啉(4-AAP)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100) 天津市科密欧化学试剂有限公司;大豆卵磷脂、胆固醇 北京奥博星生物技术有限公司。

冷冻高速离心机 Sigma公司;UV1100紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;Brukervector22傅里叶红外光谱仪 德国Bruker公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;电子天平、pH计 上海精密科学仪器有限公司;S-4800扫描电镜 JEOL公司。

1.2 实验方法

1.2.1 包覆双酶脂质体模板的制备 将卵磷脂与胆固醇以质量比4∶1溶于10 mL氯仿中,于4 ℃下冷藏保存待用。取3.6 mL上述溶液于100 mL圆底烧瓶中,减压除去氯仿,直至在烧瓶内壁形成均匀的透明薄膜[26]。加入12 mL GOx和HRP混合溶液,利用超声形成均匀的脂质体乳浊液,控制超声时间实现对模板形貌和酶活保持性的优化。

1.2.2 以脂质体为模板诱导形成氧化硅壳层 取经超声后形成粒径均匀的脂质体溶液,在搅拌速度200 r/min下依次滴加质量分数为2 mg/mL的PDADMA溶液、TMOS水解液(54.82 mmol/L硅醇溶液)。硅化1 h后离心洗涤5次[27]。

1.2.3 去除脂质体模板 将已除去游离酶和杂质的固定化酶在一定浓度的Triton X-100溶液中浸泡1 h,离心洗涤2次,得到除去模板的固定化酶。

1.2.3.1 诱导剂用量的影响 将3.6 mL卵磷脂溶液于100 mL圆底烧瓶中旋蒸成膜,加入混合酶液12 mL(其中VGOx∶VHRP=1∶2),超声水浴振荡形成均质乳化液。分别取样1 mL于2 mL离心管中。以PDADMA(2 mg/mL,0.1 mol/L PBS,pH6.88)的用量作为变量(取140、160、180、200、220、240 μL),再分别加入0.6 mL TMOS盐酸水解液,静置硅化1 h,常温300 r/min离心5 min,用蒸馏水洗涤四次后检测酶活。

1.2.3.2 超声时间的影响 本实验采用薄膜分散法制备脂质体,超声时间的长短会影响固定化酶活性。本实验以超声时间为变量(20,40,50,70,100,120,140 min),其余变量采用筛选所得最优条件,即200 μL PDADMA,硅化1 h后离心洗涤检测酶活。

1.2.3.3 前驱体水解液用量的影响 将各管中分别加入200 μL PDADMA,以TMOS盐酸水解液的用量为变量(0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 mL),静置硅化1 h,然后离心洗涤四次后检测酶活。

1.2.3.4 WGOx与WHRP比例的影响 以双酶的质量比例为变量(WGOx∶WHRP分别为1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6),按照上面优化好的条件进行实验,最后离心洗涤检测酶活。

1.2.3.5 Triton X-100浓度的影响 诱导剂和前驱体的用量采用优化得到的条件,即分别加入200 μL PDADMA,0.7 mL TMOS,静置硅化1 h后离心洗涤备用。以Triton X-100的质量浓度为变量,在30%的浓度基础上进行梯度稀释,获得浓度为0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%的溶液。各取1 mL上述溶液加入到已制得的固定化酶中浸泡1 h,离心弃上清用蒸馏水洗涤一次后,检测酶活。

1.2.3.6 不同酶比例下固定化酶重复使用性 分别将不同比例下(WGOx∶WHRP分别为1∶4,1∶3,1∶2,1∶1)的固定化酶连续反应7次,检测酶活。

1.2.3.7 储藏稳定性 分别将游离双酶和固定化双酶在4 ℃储藏30 d后,检测游离双酶和固定化双酶的剩余酶活。相对酶活R(Relative activity,%)为以同一组实验内酶活力最高点记为100%,相对酶活则为其他数据点酶活值与此最高值之比。

1.2.4 酶活测定方法 在此双酶体系中,GOx催化底物葡萄糖产生原位H2O2,HRP催化原位H2O2与苯酚反应生成有色基团,根据此反应体系在500 nm下吸光值表征双酶体系的催化速率。

1.2.4.1 底物溶液的配制 A液,0.35 mg 4-AAP和1 mL质量分数3%苯酚溶于20 mL 0.1 mmol/mL PBS中。B液,质量分数为13%的葡萄糖溶液。

1.2.4.2 游离GOx活性测定 在1 cm比色皿中,加1.5 mL A液、1.5 mL B液,充分混合,作为参比液;取一定量未固定的GOx于10 cm离心管中,加入1.5 mL A液混匀,加入1.5 mL B液的同时开始计时,测定其反应30 s时在500 nm下吸光值。

1.2.4.3 固定GOx活性测定 在1 cm比色皿中,加1.5 mL A液、1.5 mL B液,充分混合,作为参比液;取一定量固定化的GOx于10 cm离心管中,加入1.5 mL A液混匀,加入1.5 mL B液的同时开始计时,磁力搅拌反应1 min,以针筒式过滤器迅速过滤分离出固定化GOx以终止反应,测上清液在500 nm下吸光值。

1.2.5 SEM表征 固定化酶氧化硅粉体形貌采用Hitachi S-4300场发射扫描电子显微镜进行分析,样品用无水乙醇超声分散10 min,滴于硅片上,待乙醇完全挥发后观察。

2 结果与讨论

2.1 诱导剂用量

酶活随PDADMA用量的变化情况如图1所示。结果表明,当PDADMA的量为200 μL时酶活最高(相对浓度为0.02 mg PDADMA/mg脂质体,脂质体浓度为:18.75 mg/mL)。当PDADMA用量较低时不能充分发挥脂质体的模板作用,即PDADMA只能诱导少部分脂质体表面形成氧化硅微囊,其余为仅由脂质体包埋的囊状结构。脂质体本身结构比较脆弱,在外界条件干扰下(振荡、搅拌等)易发生破裂,导致包埋失效,使固定化酶在洗涤过程中流失,所以随着PDADMA用量增加酶活逐渐升高,直至达到最大值。当PDADMA用量超过最适值(酶活最高时对应的PDADMA的量)后,过量的PDADMA不仅诱导脂质体表面进行硅化,同时也使脂质体发生粘连作用,导致脂质体的比表面积减小,分散性降低,严重影响硅化质量;此外,过量游离的PDADMA会使模板失去作用,即TMOS不借助脂质体的作用而形成不规则的结构,这两者都是导致酶活逐渐下降的原因,这与前人的报道结果[26]一致。

图1 PDADMA的用量与固定化酶活性的关系Fig.1 The relationship between the amount of PDADMA and the immobilized enzyme

2.2 超声时间

超声时间对固定化酶活性的影响如图2所示。结果表明,在一定时间范围内随超声时间延长酶活逐渐升高,在50 min时达到最大,达到最大值之后随着超声时间的延长酶活逐渐降低。

图2 超声时间对固定化酶活性影响Fig.2 The effect of ultrasonic time on the activity of immobilized enzyme

2.3 前驱体水解液用量

酶活力随TMOS用量的变化情况如图3所示。当TMOS盐酸水解液的用量为0.7 mL时酶活最高(0.306 mg TMOS/mg脂质体,脂质体浓度为:18.75 mg/mL)。TMOS可以在酸性水环境中迅速水解完全,而无需使用助溶剂来提高其水解能力。TMOS水解得到带有四个硅氧键的溶胶粒子,缩聚能力极强,酶分子的加入更是加剧了溶胶粒子的缩聚速度。当前躯体TMOS的量较低时只能利用一部分脂质体在诱导剂的作用下形成纳米氧化硅微囊。随TMOS用量的增加,利用脂质体的量也逐渐升高,形成的包埋双酶的氧化硅微囊逐渐增加,酶活逐渐升高直到达到最大。由于脂质体本身为纳米级微粒,良好的分散性是保证酶与底物充分接触、产物及时扩散出微囊的必要条件,所以当TMOS的用量超过最适值后,水解生成的大量硅酸会提高环境中的离子强度,影响脂质体的分散效果[26],导致酶活逐渐下降。

图3 TMOS的用量对固定化酶活性的影响Fig.3 Effect of TMOS amount on the relativeactivity of immobilized enzyme

2.4 WGOx与WHRP比例

酶活随双酶比例的变化情况如图4所示。结果表明,随着GOx/HRP比例的降低,酶活逐渐升高,GOx催化葡萄糖分解产生的H2O2逐渐跟HRP反应。当GOx/HRP=1/4时酶活性最高,在此比例时,GOx催化葡萄糖分解产生的H2O2可能恰好与HRP反应完全,在苯酚和4-AAP的作用下产生大量粉色物质;当GOx过量时,HRP成为反应限制因素,GOx催化底物反应产生的过量H2O2,受脂质体的阻滞作用向微囊外扩散速率缓慢,导致其在氧化硅微囊中局部积累,对GOx产生抑制作用,所以此时测得的酶活较低;当HRP过量时,GOx为限制因素,其含量逐渐降低使产生的H2O2量逐渐减少,同样使双酶体系表现较低活性。

图4 双酶比例对固定化酶活性的影响Fig.4 The effect of activity of the ratio of GOx and HRP on immobilized enzyme

2.5 Triton X-100浓度的影响

酶活与Triton X-100的浓度变化关系如图5所示。结果表明在低浓度范围内随着洗涤剂浓度的升高酶活逐渐增大,经浓度为1%的Triton X-100溶液浸泡的固化酶活性最高,超过该浓度后酶活逐渐下降最后维持在0.4左右。首先,Triton X-100作为一种非离子型的表面活性剂具有洗涤去污作用,能够分解作为模板的脂质体,增加底物和酶的接触机会,有效地降低传质阻力;同时它能分解氧化硅微囊之间粘连的脂质,在一定程度上提高微囊的分散性,增大了底物进入微囊的概率[27],这两点都是导致在一定范围内随着浓度升高酶活增大的原因。当TritonX-100溶液的浓度超过一定值后,过量的去污剂不仅会分解脂质体模板,而且会破坏氧化硅微囊的骨架结构导致酶释放出来,经洗涤后流失,从而导致酶活逐渐下降。酶活降低到一定值后Triton X-100的浓度对酶活基本不再产生较大影响。

图5 Triton X-100的浓度对固定化酶活性的影响Fig.5 Effect of Triton X-100 concentration on the relative activity of immobilized enzyme

2.6 固定化酶SEM表征

采用薄膜分散法所得固定化双酶氧化硅微囊见图6,其为球形粒子,其大小在200 nm左右,表面比较光滑,彼此之间有团聚现象。

图6 固定化GOx 的SEM图 Fig.6 SEM image of immobilized GOx particles

2.7 不同比例下固定化酶重复使用性

固定化酶可以有效解决反应后产物分离和重复使用两大问题,在一定程度上可以降低生产成本。所以,固定化酶的重复使用性是评价其性能优劣的重要标准之一。固定双酶系统的重复使用性见图7。随着反应次数增加,酶活力逐渐降低。当GOx∶HRP=1∶4时,酶活力损失程度较低,一方面是因为氧化硅微囊结构将内部酶系统和外界环境隔离开来,使GOx催化葡萄糖分解产生的H2O2聚集在微囊内,为反应提供较高底物浓度的微环境,提高反应速率。另一方面,随着GOx含量升高,H2O2在反应微环境内富集现象明显,导致H2O2局部浓度过高,对HRP产生毒害抑制作用,所以随着GOx/HRP的升高酶活损失逐渐增大。另外,重复使用多次,酶的相对活性下降,这是因为每次反应会有部分酶分子泄露,而且产物富集会堵塞氧化硅的孔道,造成表观酶活下降[28]。

图7 固定化酶的重复使用性Fig.7 The number of reuses of immobilized enzyme

2.8 储藏稳定性

目前来说衡量固定化酶性能优劣的一个非常重要的指标就是储藏稳定性。如图8所示,经过30 d的4 ℃冷藏存放后,游离双酶系统活性为最初的65.5%,而固定化双酶系统则为74.1%。一般来说微生物的降解作用是酶储存过程中活力丧失的主要原因,固定化酶的微孔结构是防止微生物降解的主要屏障,所以固定化酶的储藏稳定性优于游离酶。

图8 固定化酶的储藏稳定性Fig.8 The storage stability of immobilized enzyme

3 结论

将仿生硅化与脂质体技术相结合,在室温条件下,实现了对葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的同时固定,得到粒径分布在200 nm左右的固定化酶微囊。研究发现,在200 μL PDADMA、0.7 mL TMOS、超声50 min制得的固定化酶活性最高。在此优化条件下制备的固定化酶经重复使用7次,依然达到初始催化酶活的61.46%,经一个月冷藏后酶活仍能达到最初的74.1%。固定化双酶较游离双酶表现出更高的热稳定性、操作稳定性及对变性剂的耐受能力。该固定化方法,既克服了有机载体易溶胀、机械强度差和无机载体质地脆、易破碎等缺点,又实现对氧化硅载体形貌的控制,获得了活性和稳定性较高的固定化双酶,为新型固定化酶系统的设计提供了新思路。

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权威·核心·领先·实用·全面

Immobilization of glucose oxidase and horseradish peroxidase in biomimetic silica particles

ZHOU Ran1,SONG Yu-pin1,LIU Xiao-mei1,XUN He-feng1,HOU Dong-mei1,WU Xin-rui2,LIU Ling-jun3

(1.School of Chemical Engineering,Shijiazhuang University,Shijiazhuang 050035,China;2.School of Chemical Engineering,Heibei University of Technology,Tianjin 300130,China;3.Hebei San Yuan Food Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050000,China)

The fractional step method was applied to immobilize GOx and HRP by the combination of biomimetic silicification and liposome technology,using amine as an inducer,liposome as template. The time of ultrasonic,the dosage of PDADMA,the dosage of TMOS and the concentration of TritonX-100 on the effect of enzyme activity were studied. The results showed that the immobilized enzyme prepared with 200 μL PDADMA,0.7 mL TMOS,1% Triton X-100 and 50 min for ultrasound had the highest activity. The results of SEM showed that immobilized enzyme particles were near-spheres,which were about 200 nm. The immobilized enzyme prepared under the optimal conditions could be of higher stability and recovery rate. The immobilized enzyme repeated seven cycles could still retain 61.46% of its initial activity. In the storage of the 30 days,the relative activity of immobilized GOx could still retain 74.1% of its initial activity. Thus,the stability of the double enzyme system has been significantly improved after immobilization.

biomimetic silicification;liposome;glucose oxidase;horseradish peroxidase;nanosilica microcapsule

2016-07-18

周冉(1981-)女，博士，讲师，研究方向：载体材料制备，E-mail：helly30072004@163.com。

河北省自然科学基金(H2016106034)；石家庄学院大学生创新训练计划项目(20160421)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0221-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.034