植物乳杆菌耐受口腔不良环境及其抑菌特性研究

郭夏蕾,张 健,杨贞耐

(北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,食品质量与安全北京实验室,北京工商大学,北京 100048)

植物乳杆菌耐受口腔不良环境及其抑菌特性研究

郭夏蕾,张 健,杨贞耐*

(北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,食品质量与安全北京实验室,北京工商大学,北京 100048)

拟利用前期已经筛选出的可以抑制变异链球菌的植物乳杆菌,研究了能抑制变异链球菌的植物乳杆菌在口腔应用方面的特性的研究。本研究测定了植物乳杆菌对溶菌酶、抗生素、盐和酸的耐受性,测定了五株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum,L.plantarum)K25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1的自聚集能力以及分别与变异链球菌的共聚集能力,以及研究了添加植物乳杆菌对变异链球菌自聚集能力和产胞外多糖的影响。结果表明,五株植物乳杆菌对溶菌酶都有一定耐受性,远高于人体口腔唾液的溶菌酶浓度(157 μg/mL)。五株植物乳杆菌对酸和盐也有一定的耐受性。L.plantarumYW5-1对抗生素的耐受性较强。添加L.plantarumK25、YW5-1和YW1-1上清液后可以降低变异链球菌合成胞外多糖的能力。5株植物乳杆菌中K25和YW5-1的自聚和共聚能力较强,并且添加了植物乳杆菌后,可以降低变异链球菌的自聚集能力。

植物乳杆菌,变异链球菌,口腔应用,抑菌活性

人体的口腔环境是一个由多种微生物共存形成的复杂的微生态系统[1],其中一些对口腔健康不利的细菌过度生长繁殖就会导致口腔疾病的发生[2]。龋齿是由细菌感染造成的,是一种常见的口腔疾病[3-4]。目前变异链球菌是公认的导致龋齿的主要原因,变异链球菌利用口腔中的碳水化合物形成的有机酸会腐蚀牙齿表面,导致牙齿脱矿最终形成龋齿[5]。变异链球菌能够作用于牙齿主要是因为变异链球菌有一定的黏附能力,除了氢键等物理作用的非依赖性的黏附,主要是由于变异链球菌利用蔗糖合成的胞外多糖来进行依赖性的黏附,这种依赖性黏附是变异链球菌能够黏附到牙齿表面最主要的过程[6-8]。益生菌自第一次提出以来,已经越来越多的被应用于各个领域,口腔领域也开始关注益生菌的应用[9-10]。大量研究表明,益生菌在保护口腔健康、维持口腔微生态平衡方面有重要的意义[11]。日本东海大学教授Ishikawa[12]发现,益生菌(LactobacillussalivariusTI2711,LS1)对造成牙周病的致病菌具有杀菌作用,具有预防牙周病和口臭等效果。Caglar[13]等发现食用含有双歧杆菌的冰激凌能明显减少口腔中变异链球菌的数量,而不改变乳酸菌的数量。有文献表明益生菌的作用是可以抑制变异链球菌的活性和减少变异链球菌的数量,从而降低了龋齿的发病率[14]。

前期本课题组已经筛选出了能抑制变异链球菌的几株植物乳杆菌[15],接下来将对这几株能抑制变异链球菌的植物乳杆菌对口腔各种不良环境的耐受性以及在口腔应用方面的抑菌特性进行研究,包括植物乳杆菌对溶菌酶、抗生素、盐和酸的耐受性和植物乳杆菌的自聚集能力和共聚集能力,并且研究了添加植物乳杆菌上清液对变异链球菌自聚集能力的影响,以及植物乳杆菌对变异链球菌产胞外多糖的影响。由此来评价植物乳杆菌在口腔应用中的能力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Lactobacillusplantarum(L.plantarum)K25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1 均由作者所在实验室保藏,其中植物乳杆菌K25由吉林省农科院提供;1.3771Streptococcusmutans、1.2500Streptococcusmutans、1.2499Streptococcusmutans中国普通微生物菌种保藏所;浓硫酸、无水乙醇 北京化工厂;三氯乙酸 国药集团化学试剂有限公司;溶菌酶、蒽酮、氨苄青霉素、万古霉素、链霉素、氯霉素、红霉素 北京博奥拓科技有限公司;MRS液体培养基 葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母浸粉5 g,无水乙酸钠5 g,柠檬酸钠5 g,磷酸氢二钠2 g,吐温-80 1 mL,七水硫酸镁0.5 g,硫酸锰0.05 g,加水至1000 mL,1 mol/L乙酸调pH=6.6;BHI液体培养基 心提取物 5.0 g,脑提取物12.5 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖2.0 g,NaCl 5.0 g,Na2HPO42.5 g,琼脂15.0 g,蒸馏水1.0 L,pH=7.4。

MLS-3750型高压蒸汽灭菌器 日本三洋公司;CR21GⅢ型立式高速冷冻离心机、U-3900型紫外可见分光光度计 日本日立公司;数显pH计 上海梅特利公司;ELx800型酶标仪 美国BIO-RAD仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 植物乳杆菌对溶菌酶耐受性 采用牛津杯法考察植物乳杆菌L.plantarumK25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1对溶菌酶的耐受情况。下层培养基为1.5%(w/v)的琼脂固体培养基,分别将0.3%(w/v)的MRS培养基与植物乳杆菌的混合物(107CFU/mL)均匀涂布于琼脂培养基上。轻轻插入牛津杯,将牛津杯放平,然后在每个牛津杯中加入100 μL的不同浓度的溶菌酶溶液(0.2～5.0 mg/mL),每组设置三个平行。将上述平板在37 ℃培养12 h,根据抑溶菌酶对植物乳杆菌的抑菌圈的情况分析植物乳杆菌对溶菌酶的耐受性[16]。

1.2.2 植物乳杆菌对抗生素的耐受性 在96孔板中加入 200 μL MRS 培养基,再分别添加1、2、4、8、16、32和64 μg/mL不同浓度的氨苄青霉素、万古霉素、链霉素、氯霉素和红霉素。然后将活化好的植物乳杆菌L.plantarumYW5-1培养液以10%(v/v)的接种量分别接种到 96孔培养板中,于37 ℃培养 24 h,设置三个平行实验。根据植物乳杆菌的生长情况来测定植物乳杆菌对不同的抗生素的耐受性[17]。

1.2.3 植物乳杆菌对盐的耐受性 将活化好的植物乳杆菌菌液按3%的接种量分别接种于NaCl质量分数为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%的MRS培养基中,以未添加NaCl的MRS培养基为对照组。于37 ℃培养12 h,用质量分数为0.9%的无菌的生理盐水进行梯度稀释,然后在MRS琼脂平板上涂布,每个稀释梯度做3个平行样,37 ℃培养48 h后计数。

式中:Nt为含NaCl的MRS培养基的植物乳杆菌的活菌数;N0为不含NaCl的MRS培养基的植物乳杆菌的活菌数。

1.2.4 植物乳杆菌对酸的耐受性 将活化好的植物乳杆菌菌液按3%的接种量分别接种于pH为3、4、5、6的MRS培养基中,以pH为7的MRS培养基为对照组。耐受性检测方法同1.2.3。

1.2.5 植物乳杆菌对变异链球菌产胞外多糖的影响 取活化好的Streptococcusmutans1.2499菌悬液,将含1%(w/v)蔗糖的 BHI 液体培养基分别与L.plantarumK25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1植物乳杆菌的上清液(0.22 μm滤膜)等体积混合,再将Streptococcusmutans1.2499菌液以2%的接种量接种于混合好的培养基中,37 ℃环境下培养12 h,对照组是不含上清液的培养基。变异链球菌胞外多糖的收集方法参考周学东[18]的方法。胞外多糖含量的测定用蒽酮-硫酸法,先用葡萄糖做标准曲线,进而从标准曲线中得到胞外多糖的含量。

1.2.6 植物乳杆菌和变异链球菌的自聚集能力 将植物乳杆菌L.plantarumK25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1和Streptococcusmutans1.2499、Streptococcusmutans1.3771和Streptococcusmutans10438分别在相应的培养基中接种培养,于37℃ 活化16 h,6000 r/min离心15 min后收集菌体,用磷酸盐缓冲液(pH7.0)清洗两次,再将沉淀重悬到OD600值为0.6±0.02,准确记录此时吸光值(A0)。在24孔板中每孔添加1 mL菌悬液,37 ℃(5% CO2)的条件下培养,每间隔1 h测定上清液在600 nm处的吸光值(At),共测定3 h,设置三个平行实验。计算菌体自聚集能力公式如下[19-20]:

表1 L. plantarum K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1对溶菌酶耐受性(mm)Table 1 Lysozyme tolerance of L. plantarum K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1(mm)

自聚集能力(%)=(A0-At)/A0×100。

将五株植物乳杆菌L.plantarumK25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1的上清液(0.22 μm滤膜)分别与Streptococcusmutans1.2499等体积混合,37 ℃环境下培养12 h,测定其自聚集能力,对照组是不加上清液的培养基。

1.2.7 植物乳杆菌的共聚集能力 考察五株植物乳杆菌L.plantarumK25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1分别和三株口腔变异链球菌Streptococcusmutans1.2499、Streptococcusmutans1.3771和Streptococcusmutans10438的共聚集能力。将上述五株植物乳杆菌和三株变异链球菌分别接种到对应的液体培养基中,37 ℃过夜培养,将经活化后的液体培养基于6000 r/min 离心15 min后收集菌体,用磷酸盐缓冲液(pH=7.0)清洗两次,然后将其沉淀重悬到OD600值为 0.6±0.02,准确记录五株植物乳杆菌和三株变异链球菌的菌悬液的吸光值(分别记为Ax和 Ay)。取经调节的植物乳杆菌和变异链球菌的菌悬液各500 μL,混合添加到24 孔板中,37 ℃环境下培养,每隔1 h 测定混合菌液的上清液在 600 nm 处的吸光值,记为A(x+y),共计3 h,每组设置三个平行。

利用下列公式计算植物乳杆菌和口腔变异链球菌的共聚集能力[19-20]:

共聚集能力=[(Ax+Ay)- 2×A(x+y)]/(Ax+Ay)×100

1.2.8 数据分析 采用SPSS 16.0 软件进行数据统计处理,Turkey检验方法用于实验中比较各实验组与对照组之间差异的显著性。p>0.05 表示差异不著性,p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌对溶菌酶耐受性

基于口腔环境的复杂性,人体的口腔中会含有一定量的溶菌酶,溶菌酶对有益菌也会造成一定的危害。所以作为口腔益生菌要求植物乳杆菌对溶菌酶有一定的耐受性[21]。五株植物乳杆菌L.plantarumK25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1对溶菌酶的耐受性结果如表1所示。对溶菌酶的耐受性由抑菌圈大小来表示,没有抑菌圈的代表可以耐受该浓度的溶菌酶。由表1可得,五株植物乳杆菌对溶菌酶都有一定的耐受性,基本可以耐受0.8 mg/mL的溶菌酶。其中L.plantarumYW5-1对溶菌酶的耐受性最好,可以耐受2.0 mg/mL的溶菌酶,正常人体口腔中的溶菌酶含量为(1～57 μg/mL)[22],所以L.plantarumYW5-1更容易在口腔中存活,作为口腔益生菌更有优势。

2.2 植物乳杆菌对抗生素的耐受性

人体口腔中会因为人口服抗生素等而残留一定浓度的抗生素,抗生素会对口腔中的益生菌产生一定的杀灭作用,所以对抗生素的耐受性也是衡量乳酸菌是否可以作为口腔益生菌的一大重要指标。本实验研究了L.plantarumYW5-1对不同浓度的氨苄青霉素、万古霉素、链霉素、氯霉素和红霉素五种抗生素的耐受性。结果如表2所示,对照参考文献方法可知,L.plantarumYW5-1对万古霉素表现出敏感性,对红霉素中度敏感，也可以耐受2 μg/mL的青霉素，对氯霉素和链霉素表现出较强的耐受性。所以L.plantarumYW5-1对抗生素有一定的耐受性,作为口腔益生菌有一定的在恶劣的口腔环境中存活的能力。

表2 L. plantarum YW5-1对抗生素耐受性Table 2 Antibiotic tolerance of L. plantarum YW5-1

注:“+”代表耐受,“-”代表抑制。

2.3 植物乳杆菌对盐的耐受性

人们经常会食用含盐量较高的食物,从而使口腔环境在一定时间内处于盐浓度较高的条件。乳酸菌要在口腔中定植与生存需要对盐也有一定的耐受性,才能正常发挥其在口腔中的益生作用。本实验研究了五株植物乳杆菌分别在NaCl质量分数为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%的MRS培养基中的存活率,结果如图1所示。由图1可知,随着盐浓度的增加,五株植物乳杆菌的存活率都呈现不断降低的趋势。其中植物乳杆菌K25、YW3-2、YW5-1和YW1-1的菌株存活率差异不大,盐浓度在0.5%的存活率都达到了60%以上,盐浓度在8%的时候菌株存活率也在20%以上。而SKT109的菌株存活率稍微弱点。所以五株植物乳杆菌对盐都有一定的耐受性。

图1 L. plantarum K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1对盐的耐受性Fig.1 Salts tolerance of L. plantarum K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1

2.4 植物乳杆菌对酸的耐受性

在酸性条件下变异链球菌才能对牙齿产生作用形成龋齿[23],人们食用的很多食物可以使口腔环境在一定时间内呈酸性,如大部分水果自身的pH是酸性的,有些腌制或者罐装等食物的pH可以达到3左右。所以本实验研究了五株植物乳杆菌L.plantarumK25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1分别在pH为3、4、5、6的培养基中的存活率,结果如图2所示。由图2可知,五株植物乳杆菌在pH为3时的存活率最低,在40%左右,随着培养基pH升高,菌株的存活率也在不断增加,可以达到70%左右。五株植物乳杆菌对酸的耐受性差异不明显,植物乳杆菌SKT109在酸性条件下的菌株存活率略低。

图2 L. plantarum K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1对酸的耐受性Fig.2 Acid tolerance of L. plantarum K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1

2.5 植物乳杆菌对变异链球菌产胞外多糖的影响

变异链球菌利用蔗糖产生胞外多糖是黏附到牙齿表面的关键一步,也是导致龋齿的重要的一个部分,所以乳酸菌如果可以抑制变异链球菌产生胞外多糖,就可以在一定程度上减少变异链球菌在牙齿表面的定植与黏附,对龋齿也有一定的防治作用。

葡萄糖标准曲线结果如图3所示,线性回归公式为y=0.0039x+0.0841(R2=0.9901)。根据公式可知五株植物乳杆菌分别添加了上清液的实验组和未添加上清液的对照组变异链球菌产生的胞外多糖含量,结果如表3所示。由表3可知,L.plantarumK25、YW5-1和YW1-1的实验组产生的胞外多糖的浓度与对照组有显著性差异(p<0.05),而L.plantarumSKT109和YW3-2两株植物乳杆菌的实验组与对照组无显著性差异(p>0.05)。由此可知,添加了L.plantarumK25、YW5-1和YW1-1的上清液后对Streptococcusmutans1.2499产胞外多糖的能力产生了明显的抑制作用,从而可以减少变异链球菌在口腔与牙齿表面的定植,对防治龋齿有一定的作用。

图3 葡萄糖标准曲线Fig.3 Standard curve of glucose

表3 植物乳杆菌对Streptococcus mutans1.3771产胞外多糖的影响(μg/mL)Table 3 Infuence of L. plantarum on exopolysaccharidesynthesis of Streptococcus mutans 1.3771(μg/mL)

2.6 植物乳杆菌和变异链球菌的自聚集能力

菌株通过表面分子的特异性识别在同种细菌之间的相互凝集的现象称为自聚集。自聚集能力越高的菌株,更容易在口腔中定植与繁殖。所以,对口腔健康有利的益生菌自聚集能力越高越好,而对一些口腔致病菌,则是自聚集能力越低越有利于口腔健康。五株L.plantarumK25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1的自聚集能力结果如图4(A)所示。由图4(A)可知,五株植物乳杆菌的自聚集能力有所差异,其中YW5-1和K25的自聚集能力较强,而SKT109和YW3-2的自聚集能力相对弱一些。所以,L.plantarumYW5-1与L.plantarumK25更容易在口腔中存活与繁殖,这两株菌更适合作为口腔应用的益生菌。三株变异链球菌的自聚集能力如图4(B)所示,由图4(B)可知三株菌的自聚集能力也有一定的差异,但随着时间的增加,三株变异链球菌的自聚集能力都呈上升趋势。添加植物乳杆菌上清液对变异链球菌自聚集能力的影响结果如图4(C),由图4(C)可知,添加了植物乳杆菌上清液之后,与未添加上清液的对照组比较,Streptococcusmutans1.2499的自聚集能力有着不同程度的减少,其中添加K25上清液组与对照组有着显著性差异(p<0.05),说明K25对变异链球菌的自聚集能力减小作用更强,更能减少变异链球菌在口腔中的定植,所以K25有较好的抑菌特性。

图5 Streptococcus mutans 1.2499、Streptococcus mutans 1.3771、Streptococcus mutans 10438与植物乳杆菌K25(A)、SKT109(B)、YW32(C)、YW51(D)、YW11(E)的共聚集能力Fig.5 Co-aggregations of Streptococcus mutans 1.2499,Streptococcus mutans 1.3771,Streptococcus mutans 10438with Lactobacillus plantarum K25(A),SKT109(B),YW32(C),YW51(D),YW11(E)

2.7 植物乳杆菌的共聚集能力

除了自聚集,乳酸还可以与口腔中的其他微生物发生共聚集,进而在口腔中定植与繁殖。共聚集能力越强的乳酸菌更容易在口腔中生存。五株植物乳杆菌与三株变异链球菌的共聚集能力和三株变异链球菌的自聚集能力如图5所示。由图5可知,五株植物乳杆菌都可以与变异链球菌发生共聚集,五株植物乳杆菌中L.plantarumYW5-1的共聚集能力相对较强,所以相比其他植物乳杆菌更有优势在口腔中定植与存活,有较好的抑菌特性。同一株植物乳杆菌与不同的变异链球菌的共聚集能力也有所差异。三株变异链球菌Streptococcusmutans1.2499、Streptococcusmutans1.3771和Streptococcusmutans10438的自聚集能力见图4。植物乳杆菌与变异链球菌发生共聚集后,相比较变异链球菌的自聚集能力植物乳杆菌在一定程度上减少了变异链球菌的自聚集。而对于植物乳杆菌,与变异链球菌发生共聚集后,其聚集能力相对于自聚集能力有所提高。

3 结论

在筛选出了能抑制变异链球菌的植物乳杆菌菌株基础之上,本文研究了这几株植物乳杆菌在口腔应用方面的特性,实验结果表明,这几株植物乳杆菌在口腔应用方面具有比较好的特性,其中L.plantarumYW5-1尤为突出,可以耐受2.0 mg/mL的溶菌酶,远远高于人体口腔唾液中的溶菌酶浓度。对盐和酸也有一定的耐受性。此外L.plantarumYW5-1对抗生素也具有一定的耐受性。L.plantarumYW5-1 可以减少变异链球菌产生胞外多糖。L.plantarumYW5-1的自聚集能力和共聚集能力都比较高,添加植物乳杆菌之后可以在一定程度上减少变异链球菌的自聚集能力,减少变异链球菌在口腔中的定植。所以L.plantarumYW5-1对口腔不良环境有较好的耐受能力和较好的抑菌特性,具有作为口腔益生菌的潜力。益生菌防治龋齿可以避免抗生素治疗龋齿带来的破坏口腔菌群平衡的弊端,为进一步利用乳酸菌的益生特性来防治龋齿等口腔疾病提供技术基础。

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Study on oral application characteristics of lactic acid bacteria that inhibitingStreptococcusmutans

GUO Xia-lei,ZHANG Jian,YANG Zhen-nai*

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Intends to use the pre-screened lactic acid bacterias that can inhibitStreptococcusmutans,oral application characteristics of lactic acid bacteria that inhibitingStreptococcusmutanswere studied.The study measured lysozyme,antibiotic,salts and acid tolerance ofL.plantarums,measured the auto-aggregation ability and co-aggregation ability of five lactic acid bacteria(Lactobacillusplantarum,L.plantarum)K25,SKT109,YW3-2,YW5-1 and YW1-1 withS.mutans. And the infuence ofL.plantarumon auto-aggregation and exopolysaccharide synthesis ofStreptococcusmutanswas determined. The results showed that five lactic acid bacteria have a certain tolerance for lysozyme,much higher than the concentration of lysozyme in human saliva(1～57 μg/mL). Five lactic acid bacteria also had a certain tolerance for salts and acid.L.plantarumYW5-1 showed the best tolerance to antibiotics. Adding supernatant ofL.plantarumK25,YW5-1 and YW1-1 could reduce the ability ofS.mutansto synthesizing exopolysaccharide. The auto-aggregation ability and co-aggregation of YW5-1 and K25 were best of the fiveLactobacillusplantarum(L.plantarum),and after adding lactic acid bacteria,auto-aggregation ability ofS.mutanscould be reduced.

Streptococcusmutans;Lactobacillusplantarum;oral application;inhibitory activity

2016-09-19

郭夏蕾(1991-)，女，硕士研究生，研究方向:乳品生物技术,E-mail:610850207@qq.com。

*通讯作者:杨贞耐(1965-)，男，博士，教授，研究方向:乳品科学及加工技术,E-mail:yangzhennai@th.btbu.edu.cn。

国家自然科学基金面上项目(31571857)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0215-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.033