土壤环境中典型抗生素残留及其与微生物互作效应研究进展

喻 娇， 冯乃宪， 喻乐意， 莫测辉

(暨南大学 环境学院 广东省环境污染控制与修复材料工程中心，广东 广州 510632)

抗生素是一类具有干扰、杀死微生物或生活细胞的有机化学物质，主要是由微生物(细菌、真菌和放线菌)在其生长代谢活动中产生的次级代谢产物，也可以通过化学方法人工合成[1]。抗生素在临床医疗和畜牧养殖等方面被广泛应用(表1)。抗生素在生物体内停留时间短、代谢效率低，有60%～90%的抗生素以药物原形或其代谢物随粪尿排出[2]。目前大多数养殖场粪尿和医院废水处理率较低，导致大量含有抗生素的废水、畜禽粪便和垃圾堆肥的渗滤液以污灌或粪肥形式直接进入土壤，导致抗生素在土壤环境中普遍被检出。抗生素不断进入土壤环境，被土壤颗粒吸附并累积，土壤成为抗生素主要的一个“汇”。抗生素在土壤中积累，改变土壤结构和生态功能，使土壤微生物区系发生变化，破坏微生态平衡，诱导耐药菌产生并最终导致土壤耕作力下降，农业生产效率降低[3]。残留在土壤中的抗生素被农作物吸收和累积进入食物链，对动物和人类健康构成威胁[4]。针对抗生素污染这一环境领域关切的热点问题，本文在概述土壤环境中抗生素污染现状的基础上，重点介绍了抗生素对微生物的影响以及微生物去除抗生素污染的作用，最后提出了土壤抗生素污染研究中存在的问题和今后研究方向，期望为深入研究治理土壤抗生素污染，改善我国土壤抗生素污染现状，降低生态风险提供参考。

表1 常见的抗生素类型

1 土壤环境中典型抗生素污染现状

自1981年从施用鸡粪的土壤中检测出氯四环素后，多种抗生素从土壤中被相继检出，如磺胺类和喹诺酮类抗生素[4]，浓度范围为μg/kg至mg/kg。德国[5]、加拿大[6]等发达国家在过去十几年先后从土壤中检测出多种抗生素。近几年，一些发展中国家也相继从土壤中检测出抗生素，如马来西亚土壤中磺胺嘧啶的浓度为12～5 773 μg/kg，强力霉素的最高浓度达到78 516 μg/kg[7]；巴西畜禽养殖附近土壤中恩诺沙星的检出浓度为22.93 μg/kg[8]。与国外相比，我国土壤中抗生素残留情况也不容乐观，尤其是经济发达地区检出率更高。目前我国对于抗生素污染调查主要集中在经济发达的北京、天津、“长三角”、“珠三角”以及设施农业发展较快的山东地区(图1a)。通过调查发现，有机肥中抗生素含量远高于农田土壤中抗生素的含量(图1b、1c)。可见，农业、经济的发展程度以及施用有机肥的情况与土壤抗生素污染具有一定联系，有待进一步研究。

抗生素主要通过污水灌溉、施肥、堆粪等农业生产活动进入到土壤环境。利用污水灌溉的土壤中，抗生素的浓度达到22 μg/kg，并且随着距离越靠近出水口，抗生素的检出浓度越高[19]。施用粪肥的“无公害蔬菜”生产基地土壤中喹诺酮类化合物的检出率达到92%以上，总含量为3.97～32.03 μg/kg[20]。利用畜禽粪便堆肥的农用土壤中检测出磺胺类、四环素类、喹诺酮类等多种类型抗生素，其中磺胺甲恶唑检出浓度为1.08～3.02 μg/kg，四环素浓度达到15.2 mg/kg，氧氟沙星、恩诺沙星浓度分别为335 μg/kg和96.0 μg/kg[21]。在北京11个大型温室蔬菜生产基地中的土壤和粪肥样品中均检测出多种抗生素，检出浓度为四环素类(102 μg/kg)> 喹诺酮类(86 μg/kg)>磺胺类(1.1 μg/kg)> 大环类脂类(0.62 μg/kg)[22]。本课题组从珠三角地区蔬菜土壤中检测出四环素、土霉素、金霉素3种四环素，磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶等8种磺胺类和环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星等4种喹诺酮类抗生素，其中喹诺酮类抗生素检出浓度高达1 537.4 μg/kg，并且发现在畜禽养殖场附近的蔬菜地土壤中抗生素检出浓度最高[23]。可见，土壤抗生素污染状况严重，其与农业生产方式密切相关，控制灌溉水源和肥源是有效控制抗生素污染的根本措施。

图1 我国各地区农田土壤及有机肥中抗生素含量分布Fig.1 The occurrence of antibiotic residues in soil and organic fertilizer in different regions of ChinaA北京[9-10]，B天津[11]，C上海[12-13]，D吉林[14]，E山东[14-15]，F江苏[16]，G浙江[14,17]，H1广州[4]，H2佛山[4,18]，H3惠州[4,18]，H4深圳[18]，H5东莞[4]

2 抗生素残留对土壤微生物的影响

2.1 诱导抗性基因

抗生素在土壤中累积，导致土壤微生物对其产生抗性(表 2)。至今已经多种抗性基因如大环类脂类抗性基因(mph和erm)、头孢菌素类抗性基因(bla)、氨基糖苷类抗性基因(aph和add)、四环素类抗性基因(tet)等被频繁从土壤中检出[21]，土壤已成为各种抗性基因的蓄积库。细菌长期受到抗生素的选择压力，主要通过基因的水平转移经过土壤介质传播获得相应的抗性基因[24]。抗性基因在土壤生态系统中广泛存在，通过移动遗传元件在细菌种群之间发生水平转移，如抗性基因利用接合性质粒、转座子、整合子和基因组岛等遗传元件通过转化、接合和转导等方式实现其与土著微生物进行交换，将外源基因转化给土著微生物[25]。

表2 微生物对抗生素的抗性机制

在农业生产活动中，污水灌溉和畜禽粪肥施用使得大量抗生素、抗性基因和抗性菌株进入农田土壤，导致抗性基因在土壤中的被诱导和传播，对植物、动物或微生物产生一系列潜在的生态风险。在土壤中反复施加含磺胺类抗生素的粪肥，土壤中磺胺类抗性基因显著提高[26]。在施用猪粪肥的土壤中检测出多种喹诺酮类抗生素抗性基因，他们可能来源于猪粪[27]。利用猪场废水灌溉农田，土壤中抗性基因tetQ、tetZ分别提高了500和9倍[28]。土壤中抗性基因的含量和丰度与相应的抗生素含量之间存在联系[29]，如养殖场附近或施用猪粪肥土壤中四环素抗性基因tetM、tetO、tetQ和tetW等的绝对拷贝数与相应抗生素残留量存在正相关[30]，并且发现畜禽粪便中sulII基因的丰度与相应抗生素含量呈正相关[12]。

农田土壤中的抗性基因可能会在土壤微生物、蔬菜以及畜禽动物之间水平转移，并在动植物体内富集，威胁食品安全，带来极大的健康风险[31]，如在畜禽类发酵制品中的益生菌体内检出了四环素类、链霉素类和β-内酰胺类抗性基因[32]；在家禽肉、猪肉及香肠制品中也发现了四环素类、氨基糖苷类和β-内酰胺类抗性基因[33]。同样，在新鲜蔬菜(如西红柿、辣椒、黄瓜、胡萝卜及生菜)[34]及蔬菜沙拉中发现了多种抗性基因[35]。

2.2 影响土壤微生物群落结构和功能

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，是衡量土壤肥力的重要指标。抗生素在土壤中累积，抑制其靶标微生物的繁殖和代谢活动，选择性的诱杀土著微生物或者诱导抗性菌株的产生，其他未受到抑制的微生物能够获得大量资源而快速繁殖，改变微生物群落组成和功能，破坏土壤微生态平衡，影响土壤肥力。

外源添加青霉素对茶园土壤细菌、放线菌和真菌都具有一定的抑制作用，低浓度的四环素显著抑制细菌和放线菌的生长[36]；长期抗生素暴露下，土壤中细菌/真菌和G-/G+比例发生改变，如磺胺嘧啶污染使土壤中细菌/真菌比例下降[37]，而四环素或青霉素处理茶园土壤后G-/G+比值升高[36]。抗生素对土壤微生物的影响因抗生素种类、浓度和土壤性质的不同有较大差异。研究表明，与四环素和环丙沙星相比，磺胺甲恶唑具有较强的生物可利用性，对土壤微生物影响会更大[38]。红霉素轻度污染能显著抑制氨氧化细菌的生长，而中度和高度污染对土壤氨氧化细菌有增益作用[39]。在粘土中加入50 mg/kg的三氯生明显抑制土壤的呼吸作用，在沙质土壤中却没有类似现象[40]。

土壤中残留的抗生素不但改变土壤微生物群落结构，而且会抑制土壤呼吸作用，降低微生物对碳源的利用率，干扰功能微生物参与土壤生态系统元素循环，危及土壤生态系统平衡。研究发现磺胺嘧啶、氧四环素和诺氟沙星3种抗生素对土壤呼吸的最大抑制率分别为76.8%、20.7%和21.9%，并且高浓度的抗生素对土壤微生物的硝化作用均表现出不同程度的抑制作用[41]。外源土霉素和磺胺二甲嘧啶对土壤活性有机碳含量产生明显影响，其中土壤微生物碳和易氧化碳含量呈现降低趋势，而水溶性有机碳和溶解性有机碳含量产生积累效应[42]。此外，施用含有磺胺嘧啶的粪便作为有机肥，土壤中参与硝化和反硝化作用的氨氧化古菌丰度和多样性发生明显降低[43]。土壤土霉素污染可抑制土壤氨氧化微生物，改变其微生物群落结构多样性，进而影响土壤中氮元素的生物地球化学过程[44]。

目前，应用分子技术研究抗生素对土壤微生物群落影响的工作已广泛开展，如利用T-RFLP(末端限制性片断多样性)方法研究土霉素对微生物群落结构的影响，结果表明土霉素对茶园土壤细菌、放线菌和真菌都具有一定的抑制作用，低浓度的四环素显著抑制细菌和放线菌的生长[45]。但是这些方法不能同时定性和定量，对微生物群落结构研究具有一定局限性。宏基因组技术与传统分子指纹图谱技术相比能够解析复杂环境中微生物群落物种组成和相对丰度[46]。目前，该技术主要应用于研究抗生素对水环境微生物群落影响[47]，而对于抗生素胁迫下土壤中微生物群落结构变化鲜有报道。

3 土壤中抗生素微生物消减方法

3.1 微生物降解

微生物降解是去除土壤中抗生素污染的重要方式。近年来关于抗生素微生物降解的研究已引起国内外学者的广泛关注(表3)。研究发现磺胺甲恶唑在土壤中易发生好氧降解，结果显示浓度为40 μg/kg的磺胺甲恶唑微生物降解显著[48]。通过改变土壤养分水平和种植蔬菜等方式提高土壤微生物活性，促进土壤中磺胺二甲嘧啶的微生物降解[49]。如施用粪肥能够增加土壤中有机质含量，促进微生物代谢活性和降解能力，加快磺胺类药物在混合基质中的降解速率。微生物降解作用是土壤磺胺类抗生素降解的主要途径。但是微生物对抗生素的降解能力表现出很大的差异，Alexy等[50]发现微生物对苄青霉素的降解率为27%，阿莫斯林降解率为5%，制霉菌素和甲氧苄氨嘧啶的降解率为4%，其余抗生素的降解率均低于4%。

除自然条件下的微生物降解以外，高效降解菌株的筛选和基因工程菌的研究是微生物处理土壤抗生素污染的主要研究方向。目前，关于微生物对抗生素降解的研究主要有喹诺酮类抗生素环丙沙星和诺氟沙星[51]、四环素类抗生素[52]、头孢类抗生素[53]以及磺胺类抗生素[54]等。从抗生素制药厂、药渣中筛选出四环素高效降解酵母菌(TrichosporonmycotoxinivoransXPY-10)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)等，对四环素降解率达到83%以上[52]；接种土霉素高效降解葡萄球菌(Staphylococcussp. TJ-1)能够将猪粪中土霉素的降解效率提升约20%[55]。另据报道，木质素分解真菌(Pleurotusostreatus)能够降解土霉素，并且土霉素的降解产物为2-乙酰-2-去酰胺土霉素[56]。从长期堆放泰乐菌素药渣附近土壤中筛选出的越南伯克霍尔德菌(Burkholderiavietnamiensis)能够有效降解泰乐菌素；同样来源的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)也能够有效降解泰乐菌素[57]。嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)和苍白杆菌属(OchrobactrumhaematophilumAW1-12)对阿维菌素有很强的降解能力[58-59]；郭夏丽等[60]发现在固定化培养后黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)对磺胺甲恶唑的去除率达到100%，其较优碳源和氮源分别是葡萄糖和酒石酸铵。由此可见，利用微生物降解消除土壤抗生素污染是可行的。

表3 抗生素的主要降解途径及降解酶

抗生素微生物降解通常受众多环境因素的影响，如温度、pH、供养情况、生物量等。活性污泥中丰富的碳源和氮源能够影响微生物对抗生素的降解效果，通过优化活性污泥中碳源和氮源配比，针对不同抗生素筛选培养特异性高效降解菌株加入到活性污泥系统中，调节活性污泥系统温度，均能够提高抗生素的降解效果[54]。活性污泥作为国内外污水处理重要方式，通过对活性污泥中抗生素降解菌的研究，去除污水中抗生素残留，降低污水灌溉对土壤抗生素污染的生态风险。并且，可以直接利用活性污泥中抗生素降解菌解决土壤抗生素污染问题。

3.2 堆肥降解

堆肥技术是一种经济有效的无害化去除畜禽粪便和污泥中抗生素的方法，主要利用微生物活动和环境条件(如水分、含氧量、温度、pH和堆料C/N等)的共同作用降低粪肥中抗生素的浓度，达到有效去除土壤中残留抗生素的目的，对四环素类、磺胺类和大环内酯类抗生素的消除效率可达50%～70%[62-63]，如堆肥处理可以去除猪粪中70%～92%四环素类抗生素[64]，鸡粪中48.4%～77.1%的氟喹诺酮类抗生素[65]以及污泥中85%以上的四环素类抗生素[66]，而磺胺嘧啶则可完全降解[67]。通过人为控制堆肥条件，促进堆肥中微生物代谢活性，提高微生物体内降解酶的降解能力，进而加速堆肥中抗生素的去除，如翻堆+机械通风能够促进堆肥腐熟进程，提高堆体温度，可以有效去除猪粪中磺胺二甲嘧啶、土霉素、金霉素和泰妙霉素[68]，较高的初始C/N(25.5～32.8)能够有效降解鸡粪堆肥中土霉素的降解[69]。

添加微生物菌剂也能促进堆肥中抗生素的去除，如添加枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌混合菌剂，可以提高鸡粪堆肥的高温期温度，能够提高土霉素的降解速率[70]。添加高效降解纤维素及金霉素和土霉素的复合菌剂能够促进鸡粪堆肥中金霉素和土霉素的降解[71]；接种外源耐高温产纤维素酶和蛋白酶菌种可以将喹诺酮类抗生素的去除率提高3.3%～7.2%，且诺氟沙星和洛美沙星的去除率显著提高[65]。因此，畜禽粪便和污泥堆肥无害化处理有利于减少畜牧养殖业对土壤环境抗生素污染，具有广阔的应用前景。

3.3 酶降解

通过微生物降解酶去除土壤中抗生素的研究取得了一定进展。白腐真菌产生的天然木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶对四环素和土霉素的降解效率分别为72.5%和84.3%[72]，其所产生的漆酶对环丙沙星的降解率达到97.7%[51]。番薯链霉菌产生的漆酶在碱性条件下可使两种喹诺酮类抗生素环丙沙星和诺氟沙星的毒性分别降低90%和70%[73]。利用氯过氧化酶为催化剂，双氧水为氧化剂对降解磺胺类抗生素和林可酰胺类抗生素的降解率达90%以上。谷胱甘肽转S-转移酶可以降低四环素、磺胺噻唑和氨苄青霉素的微生物毒性[74]。

4 问题与展望

我国作为抗生素消费大国，土壤抗生素污染状况严重。抗生素残留对微生物的生态毒性主要表现在其对土壤微生物结构功能的影响和诱导抗性基因。由于污水灌溉和畜禽粪肥的施用，使抗生素污染物源源不断的输入土壤中，而依靠抗生素在土壤中缓慢自然消减很难在短时间内缓解土壤抗生素污染现状。寻找抗生素高效降解微生物是解决当前土壤抗生素污染问题的重要方法。目前对土壤抗生素污染微生物去除和修复的报道还比较少，目前大都还处于实验室研究阶段，抗生素微生物降解途径、降解机制尚不清晰，因此亟需从以下几个方面深入研究：①筛选高效降解抗生素的复合菌系，通过菌株之间的相互协作，利用共代谢机制完成对难降解抗生素的有效去除。目前仅有很少报道能够降解环丙沙星的微生物菌株。本研究组已经筛选出多株喹诺酮类抗生素降解菌，发现多菌株协作降解喹诺酮类抗生素的效率高于单菌。②对微生物降解抗生素的关键酶和关键基因进行研究，深入研究微生物降解途径和降解产物。③土壤抗生素污染是多种抗生素共存，研究能够同时降解多种抗生素的复合功能菌株或微生物复合菌剂并联合植物修复是解决土壤抗生素污染的工作重点。

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