兰州市空气微生物群落的碳代谢特征及功能多样性研究

姜金融， 薛林贵*， 尚 海 ， 马 萍， Erhunmwunsee Famous， 褚可成

(1.兰州交通大学 化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省极端环境微生物资源与工程重点实验室，甘肃 兰州 730070；3.甘肃省环境监测中心站，甘肃 兰州 730020)

空气微生物是城市生态系统的重要组成部分，已知存在于空气中的细菌及放线菌约有1 200种、真菌40 000种，其组成浓度不稳定，种类多样，主要来源于土壤、水体、动植物、人体以及污水处理、动物饲养等各种生产活动[1-2]。空气微生物与生态平衡及许多生命现象直接相关，在自然界的物质循环中起着非常重要的作用[3]。目前，对于城市空气微生物的研究主要集中在浓度粒径分布特征、群落结构及对人群健康风险评价等方面[4-6]，而针对城市生态系统中空气微生物群落代谢功能多样性及其与环境因子的相关性研究较少。Biolog微平板可同时测定微生物群落对不同单一碳源的利用能力，通过微生物代谢指纹多维表征微生物群落总体活性、碳代谢功能多样性信息，Biolog技术已广泛应用于环境微生物群落的研究。本研究采用Biolog-ECO技术和RDA分析对兰州市不同功能区空气微生物群落代谢功能多样性进行研究，比较分析不同功能区微生物群落代谢差异及其与环境因子的相关性，以期为准确了解城市空气微生物群落与生态功能奠定基础，为空气微生物对人们健康、空气环境质量影响评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究地点

选取兰州市4个不同功能区：风景区(Scenic Area，SA)、交通干线(Main Traffic Line，MTL)、公共服务区(Public Service Area，PSA)和文教区(Culture and Education Area, CEA)，分别以兴隆山、兰州火车站、省医院、兰州交通大学为监测点。兴隆山是旅游风景区，周边基本没有建筑，人流量较小，无车辆通行，绿化率大于95%；兰州火车站是主要交通干线，周边有酒店、银行、商贸城等建筑，人口及车流量较大，绿化率基本为零；省医院是人流来往频繁的公共场所，周边有居民楼、研究所，车流量一般，绿化率较小；兰州交通大学是文教区，周边有图书馆、寝室楼、教学楼等，上下课时间人流量较大，车流量较少，绿化率约40%。

1.2 样品采集

使用液体撞击式空气微生物采样器进行空气样品的采集， 采样时间为2016年4月中旬，每个监测点分别于9:00、13:00和17:00取样3次，每次2个重复。每次空气样品采样流量为12.5 L/min，采样时间1 h，采集于15 mL PBS缓冲液中，避光4 ℃保存。采样期间利用AR866风速仪测定风速，利用TES1360A温湿度计测定环境温度湿度，利用UV-B型紫外辐照计测定UVB强度(表1)。

表1 采样点环境因子

1.3 基于Biolog-ECO 板的操作

应用Biolog-ECO板解析兰州市空气微生物群落代谢功能多样性。每个监测点每天的采样液混合均匀后分别用八道加样枪接种至ECO板中，接种量为150 μL/孔，将接种好的微平板放入30 ℃培养箱恒温培养，每隔24 h用Biolog仪测定590 nm和750 nm下的光密度值，连续测定10 d。

1.4 数据分析方法

微生物群落碳源代谢活性用平均颜色变化率[7](Average well color development， AWCD)表示：

AWCD=Σ(Ci-R)/n

式中：Ci为每个有培养基孔的光密度值；R为对照孔的光密度值；n为培养基碳源种类，本研究中为31。

选取培养192 h后的Biolog数据进行主成分分析(PCA)，功能多样性指数及不同碳源利用率的计算。Shannon指数(H′)可评估群落物种的丰富度，McIntosh指数(U)用于反映群落物种的均一度[8]：

H′=-Σ(Pi·lnPi)

式中：Pi为有培养基的孔和对照孔的光密度值差与整板总差的比值，即Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)，ni=Ci-R，这样就可以消除在操作及培养过程中对吸光度变化带来的影响，对变量进行标准化。

Simpson指数(D)[9-10]又称优势度指数，用于评估最常见种的优势度，是对碳源利用多样性方面的表达，但其更加侧重对差异性的描述。Simpson指数(D)：

D=1-∑Pi2

数据的统计与分析应用Excel 2007软件，Origin 8.5完成相关绘图；PCA分析及单因子方差分析(one-way ANOVA)应用SPSS 20.0软件进行；RDA分析应用Canoco软件。

2 结果与分析

2.1 空气微生物群落碳源代谢活性变化

平均颜色变化率(AWCD)从代谢水平上揭示微生物群落功能多样性，可反映空气微生物群落对31种碳源总体的利用强度。图1是兰州市不同功能区空气微生物AWCD值变化情况，随着培养时间的延长，不同功能区空气微生物对碳源的利用量呈逐渐增加趋势，并具有显著的空间差异(P<0.01)。具体表现：培养24 h后不同功能区的AWCD开始出现较大分化，192 h时进入稳定期，SA和PSA的碳源代谢活性明显高于MTL和CEA(P<0.01)，SA与PSA存在显著差异(P<0.01)，对碳源总体的利用能力呈现SA>PSA>CEA≈MTL的趋势。

图1 不同功能区空气微生物AWCD变化Fig.1 Average well color development changes of airborne microbes in different function regions

2.2 空气微生物利用不同类型碳源的特征差异

兰州市不同功能区空气微生物对6大类碳源(糖类7种、氨基酸类6种、酯类4种醇类3种、胺类3种、酸类8种)的相对利用率如图2所示，SA和PSA空气微生物对不同碳源的利用率高于其他两个功能区，方差分析表明不同功能区空气微生物对6类碳源的利用均存在显著差异(P<0.01)。兰州市空气微生物以利用酯类、氨基酸类及醇类为主，其中对酯类的利用强度SA最高，PSA次之，两者无显著差异(P>0.05)，但均显著高于MTL和CEA(P<0.01)。空气微生物对胺类代谢水平最低，且不同功能区间差异显著(P<0.01)。同一功能区对不同碳源的利用也存在差异。

图2 不同功能区空气微生物对不同碳源的相对利用率Fig.2 Relative utilization ratio of different carbon sources by airborne microbes in different function regions不同字母表示同类型碳源在不同功能区间差异显著(P<0.05)Different letters for the same carbon source meant very significant difference among different function regions at 0.05 level

2.3 空气微生物群落功能多样性分析

不同功能区空气微生物多样性指数见表2，分析表明：各多样性指数均具有显著的空间差异(P<0.05)，SA的Shannon指数，McIntosh指数明显高于其他三个功能区(P<0.01)，说明SA空气微生物物种丰度及均一度最大，其次是PSA，MTL最低；对于Simpson指数而言，SA和PSA较高，显著高于MTL和CEA(P<0.01)，SA空气微生物常见物种的优势度最高，CEA最低。

表2 空气微生物功能多样性指数的空间变化

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.4 空气微生物群落代谢功能主成分分析

利用主成分(PCA)分析法分析兰州市不同功能区空气微生物群落代谢功能(图3)，主成分1(PC1)贡献率为56.839%，主成分2(PC2)贡献率为33.107%，两者累计贡献率为89.946%，已达到85%以上，不需要再增加主成分。PC1中载荷大于0.9的基质有10种，包括氨基酸类(3种)、酸类(2种)、酯类(2种)、糖类(1种)、胺类(1种)、醇类(1种)；PC2中载荷大于0.9的基质6种，包括酸类(3种)、糖类(1种)、醇类(1种)、胺类(1种)(表3)。分析表明，兰州市空气微生物碳源利用方式存在显著的区域性差异(P<0.01)，按碳源利用相似性可分为三类，其中，MTL和CEA的代谢类群散点较接近，两者无显著差异(P>0.05)可归为一类；SA、PSA类群散点均与MTL和CEA的散点距离较大(P<0.01)，且这两区域间代谢功能也存在显著差异(P<0.05)，因此，MTL归为一类，PSA归为一类。与主成分显著相关的主要基质类型与空气微生物利用率较高的碳源类型一致，PC1中载荷较大的基质是导致兰州市空气微生物群落代谢功能区域性差异的主要分异类型。

图3 不同功能区空气微生物碳源利用的主成分分析Fig.3 Principal component analysis ( PCA) of carbon utilization profiles of airborne microbes in different function regions

类型基质主成分PC1(r)PC2(r)糖类肝糖0.91α-D-乳糖0.921氨基酸类L-苯基丙氨酸0.929L-丝氨酸0.976甘氨酰-L-谷氨0.939酯类吐温-400.934吐温-800.941醇类D,L-α-甘油0.957I-赤藻糖醇0.936胺类N-乙酰基-D-葡萄胺0.959腐胺0.931酸类D-氨基葡萄糖酸0.952D-苹果酸0.9392-羟苯甲酸-0.9244-羟基苯甲酸0.942衣康酸0.949

2.5 空气微生物群落功能多样性的空间差异与环境因子的相关性

研究表明，空气微生物群落功能多样性与环境因子具有一定的相关性[11-12]。兰州市不同功能区空气微生物群落功能多样性(碳源代谢水平和功能多样性指数)与环境因子之间的关系如图4所示，从排序结果可以看出不同功能区空气微生物功能多样性差异明显，PSA和SA位于第一排序轴的正端，而MTL和CEA位于负端；PSA和MTL位于第二排序轴的正端，SEA和SA位于负端。第一排序轴与风速(0.895 3)、湿度(0.402 1)呈正相关，与温度(-0.626 6)、UVB(-0.253 3)呈负相关；第二排序轴与温度(0.768 7)、UVB(0.549 9)呈正相关，与风速(-0.419 6)、湿度(-0.271 2)呈负相关。Shannon指数、McIntosh指数、Simpson指数分别与风速(r=0.862、r=0.855、r=0.775)，湿度(r=0.356、r=0.356、r=0.465)呈正相关；与温度(r=-0.572、r=-0.56、r=-0.428)，UVB(r=-0.193、r=-0.187、r=-0.241)呈负相关。综合分析，兰州市不同功能区空气微生物功能多样性具有显著差异，温度和风速是导致空气微生物功能多样性空间差异的主要影响因子。

图4 空气微生物功能多样性的空间差异与环境因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of spatial variation of carbon metabolic function of airborne microbes with environmental factors

3 讨 论

Biolog ECO微平板主要用于微生物特性及群落的分析研究，通过微生物群落对不同碳源的利用能力来表征其代谢功能多样性，可反映不同时间或空间尺度上的差异性[13-14]。微平板对接种的微生物样品有一定的浓度和活性要求，本研究利用液体撞击式空气微生物采样器进行空气样品的采集，可有效保持样品采集的全面性及微生物的生理活性[15]。研究发现，兰州市不同功能区空气微生物的碳源总体利用强度和多样性指数均存在显著差异(图1、表2)。其中，SA的碳源总体利用能力、多样性指数最高，可能是由于该地区植被丰富、环境湿润为空气微生物的存在生长提供了良好的环境，导致该功能区空气微生物碳代谢活性高，具有较高的物种丰度和均匀度，这与吴等等等[11]的研究结果一致；MTL最低，该地区受人流及其他外界因素干扰较大，空气中大量存在一些抗逆性较强的微生物(如芽胞杆菌等)，导致碳代谢能力降低[16]。不同功能区McIntosh指数差异明显，SA和PSA较高，说明两地区空气微生物群落较均一，存在相对稳定的群落结构，而MTL和CEA受外界因素干扰大，均一度较低。

兰州市四个功能区空气微生物碳源代谢优势群落主要为酯类、氨基酸类及醇类利用类型，主成分分析发现氨基酸类是导致兰州市空气微生物群落代谢功能区域性差异的主要分异类型。吴等等等[11]研究发现羧酸类是青岛市空气微生物碳源代谢差异的主要分异类型，以上研究结果与本研究存在差异，这是由于不同地域或不同环境因子会导致空气微生物碳代谢特征的区域性变化，说明空气微生物群落代谢功能与其所处的生境环境因子密切相关。RDA分析发现，兰州市不同功能区空气微生物群落功能多样性与环境因子之间有较好相关性，其中温度和风速与碳代谢水平及功能多样性指数呈现较大相关性，适宜的温度能够保持微生物的生理活性[17]而风速会影响空气微生物的群落组成及浓度变化[18]，温度、风速是导致兰州市空气微生物功能多样性空间差异的主要影响因子。

Biolog ECO 微平板通过呈现不同的多维数据来表征微生物群落的代谢功能多样性，是研究环境微生物多样性的主流方法之一[19]。但由于空气微生物组成多变，群落结构与功能多样性关系复杂，Biolog 方法只能通过测定微生物对不同碳源利用程度的差异来表征其功能多样性，今后应该结合分子生物学方法，为准确了解城市空气微生物多样性及其生态功能提供有效途径。

[1] Song LH, Song WM, Shi W, et al. Health effects of atmosphere microbiological pollution on respiratory system among children in Shanghai[J]. Journal of Environment and Health, 2000, 17(3): 135-138.

[3] Mancinelli RL, Shulls WA. Airborne bacteria in an urban environment[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1978, 35(6): 1095-1101.

[4] Chang CY, Tseng L, Yang LS. Microbial air contamination in an intensive care unit[J]. International Journal of Public Health Science, 2015, 4(3): 145-151.

[5] Kim KY, Kim CN. Airborne microbiological characteristics in public buildings of Korea[J]. Building and Environment, 2007, 42(5): 2188-2196.

[6] Zhang BY, Liu F, Bai XT. Progress on health risk assessment of pathogenic microorganism aerosol[J]. Journal of Environmental Hygiene, 2015, 5(3): 287-292.

[7] Classen AT, Boyle SI, Haskins KE, et al. Community-level physiological profiles of bacteria and fungi: plate type and incubation temperature influences on contrasting soils[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2003, 44(3): 319-328.

[8] Garland JL. Analysis and interpretation of community-level physiological profiles in microbial ecology[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1997, 24(4): 289-300.

[9] 闫法军, 田相利, 董双林,等. 刺参养殖池塘水体微生物群落功能多样性的季节变化[J]. 应用生态学报, 2014, 25(5): 1499-1505.

[10]Harch BD, Correll RL, Meech W, et al. Using the Gini coefficient with BIOLOG substrate utilisation data to provide an alternative quantitative measure for comparing bacterial soil communities[J]. Journal of Microbiological Methods, 1997, 30(1): 91-101.

[11]吴等等,宋志文,徐爱玲,等. 青岛市不同功能区冬季空气微生物群落代谢与多样性特征[J]. 生态学报,2015,35(7) :2277-2284.

[12]段魏魏,娄恺,曾军,等. 塔克拉玛干沙尘暴源区空气微生物群落的代谢特征[J]. 环境科学,2012, 33(1): 26-31.

[13]Preston-Mafham J, Boddy L, Randerson PF. Analysis of microbial community functional diversity using sole-carbon-source utilisation profiles-a critique[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2002, 42(1): 1-14.

[14]郑丽萍, 龙涛, 林玉锁, 等. Biolog-ECO 解析有机氯农药污染场地土壤微生物群落功能多样性特征[J]. 应用与环境生物学报, 2013, 19(5): 759-765.

[15]Griffin DW, Gonzalez C, Teigell N, et al. Observations on the use of membrane filtration and liquid impingement to collect airborne microorganisms in various atmospheric environments[J]. Aerobiologia, 2011, 27(1): 25-35.

[16]Griffin DW. Atmospheric movement of microorganisms in clouds of desert dust and implications for human health[J]. Clinical microbiology reviews, 2007, 20(3): 459-477.

[17]Mouli PC, Mohan SV, Reddy SJ. Assessment of microbial(bacteria) Concentrations of ambient air at semi-arid urban region: Influence of meteorological factors[J]. Applied Ecology and Environmental Research, 2005, 3(2): 139-149.

[18]Di Giorgio C, Krempff A, Guiraud H, et al. Atmospheric pollution by airborne microorganisms in the city of Marseilles[J]. Atmospheric Environment, 1996, 30(1): 155-160.

[19]Zhang YY, Qu LY, Chen LD. An amendment on information extraction of Biolog EcoPlateTM[J]. Microbiology, 2009, 36(7): 1083-1091.