外周血Th17、Treg细胞水平在溃疡性结肠炎和克罗恩病中的比较研究

尚 瑞，吴 军，郑雪皎，卢光新，杨艳果

湖北医药学院附属人民医院 1.消化内科； 2.药学部，湖北 十堰 442000

外周血Th17、Treg细胞水平在溃疡性结肠炎和克罗恩病中的比较研究

尚 瑞1，吴 军1，郑雪皎2，卢光新1，杨艳果1

湖北医药学院附属人民医院 1.消化内科； 2.药学部，湖北 十堰 442000

目的 观察溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)外周血单个核细胞 (PBMCs) 中Th17、Treg细胞水平和IL-17 mRNA表达水平的差异。探讨Th17和Treg在UC和CD发病机制中的作用。 方法 选取2014年1月-2015年12月在湖北医药学院附属人民医院住院治疗的IBD患者100例，其中UC患者50例，CD患者50例，应用流式细胞仪技术检测两组患者外周血中Th17与Treg细胞比例。应用实时荧光定量PCR技术检测两组患者IL-17和Foxp3 mRNA 水平的变化。结果 CD患者组外周血 Th17 细胞比例为(2.01±0.59)%，UC 患者外周血Th17 细胞比例(4.55±0.75)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；CD患者组外周血Treg细胞比例为(6.08±2.10)%，UC患者为(3.27±0.97)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。UC患者组IL-17 mRNA水平约是CD患者的4.5倍；UC患者组Foxp3 mRNA水平约是CD患者的0.4倍，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 Th17与Treg细胞比例在UC和CD中有显著性差异，可为临床UC和CD提供新的诊断方法，从而提高UC和CD诊断的正确率。

炎症性肠病；溃疡性结肠炎；克罗恩病；Th17细胞；Treg细胞；IL-17

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)，是一种常见的慢性特发性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)。近些年来IBD的发病率呈出急速增长的趋势[1-2]。其确切发病机制虽然至今未知，但是有研究数据表明，其发病的部分原因是由于易感体质肠道菌群放松了对宿主的免疫反应[3-4]。免疫反应在其发病机制中发挥着最主要的作用，而CD4+CD25+Foxp3+调节性 T 细胞(Treg)和辅助性T 细胞17(Th17)是参与免疫反应的两种关键性细胞。Treg和Th17是异于 Th1 和 Th2 的 CD4+T淋巴细胞。Treg 细胞是CD4+T 细胞的一类特殊分支，主要作用是维持免疫系统的稳定性以及耐受性，并且在防止免疫炎症反应的增加和保护免疫机体上也发挥重要作用。近几年，在许多动物和人的研究中得知，丢失Treg细胞将会造成严重的自身免疫性炎症的发生；相反，增加Treg 细胞也不利于机体健康，在许多癌症中，增加的Treg 细胞通过与自身免疫监控系统相互作用，抑制抗肿瘤免疫活性细胞的活性，促进肿瘤发生、发展。Foxp3 是 Treg 细胞的特异性标记物，作为转录因子 Forkhead 家族的一员，具有调控 Treg 细胞生长发育的作用。而特异性产生IL-17的Th17细胞则被认为是存在于天然性免疫系统与获得性免疫系统之间的桥梁，是炎症反应的使动和调节因素[5-8]。Th17 细胞在固有免疫、适应性免疫和自身免疫方面均发挥至关重要的作用。Th17 细胞在炎症反应的过程中主要发挥促进炎症反应的功效。

Treg 细胞和 Th17 细胞之间存在复杂的相互作用关系，在分化上二者相互协同，在功能上又相互竞争，其平衡在炎症反应中起关键性作用。目前，Th17/Treg 两种细胞的平衡紊乱已成为新的研究热点，但是在CD和UC中研究很少。所以本文主要就两种细胞在UC和CD中存在的比例差异进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月-2015年12月在湖北医药学院附属人民医院住院治疗的IBD患者，UC患者(活动期)50例，男女比例为28∶22，年龄(45.45±8.34)岁，CD患者(活动期)50例，男女比例为26∶24，年龄(48.35±7.56)岁。诊断标准按照中华医学会消化道学分会制定的关于IBD诊断标准[9]。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。两组患者均采集肘静脉肝素抗凝血2.0 ml和EDTA抗凝血2.0 ml。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准：(1) UC的纳入标准：连续性结膜、无肉芽肿、结直肠受累；(2) CD的纳入标准：从口腔至肛门慢性肉芽肿损害；呈跳跃性，延长轴或肠周或分散的溃疡的非连续性病变；活检黏膜可见黏蛋白滞留。

1.2.2 排除标准：(1) 以各种有效的诊断方法，如细菌学、放射学、组织学排除感染性结肠炎、缺血性结肠炎、放射性结肠炎等；(2) 怀疑有结肠癌变的患者；(3) 心、肾功能显著下降的患者；(4) 存在其他免疫学疾病的患者。所有入选患者均经过医院伦理委员会批准，并且需取得每位患者的同意并签署相应的书面同意书。

1.3 试剂和仪器

1.3.1 试剂：布雷非得菌素A(BFA)、4%多聚甲醛(PFA)、细胞因子刺激剂(PMA)。FITC-IL-17流式抗体，APC-CD4流式抗体，FITC-CD25流式抗体，PE- Foxp3流式抗体均购自美国BD公司。逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自中国全式金生物技术有限公司。

1.3.2 仪器：流式细胞仪(美国BD公司)；实时PCR仪(Life Technologies)。

1.4 流式细胞术 用流式细胞术检测两组患者外周血PBMCs中细胞亚群Th17和Treg的比例。用IL-17抗体染色结果显示为阳性的细胞群称作Th17细胞，将CD4+CD25+Foxp3+三种抗体染色均显示为阳性的细胞群称作Treg细胞。

1.4.1 Th17细胞的检测：用含有 100 g/L胎牛血清(FBS)的 1640 培养基，将PBMCs的浓度调节为 (1～5)×105个/ml； 一支试管加入淋巴细胞刺激剂混合液 3 μl(对照组不加淋巴细胞刺激剂混合液)；将试管放置于 37 ℃，且体积分数5% CO2细胞培养箱中，孵育5 h；孵育完成后以 800 r/min 离心 5 min，去上清液；用 2 ml PBS 清洗两次，800 r/min 离心 5 min；加入固定剂 100 μl，于漩涡震荡器上震荡 2～5 s混匀，然后避光，室温孵育15 min，后加入3 ml PBS 洗液，800 r/min 离心 5 min，弃上清；加入100 μl破膜剂，避光孵育5 min，后不需清洗直接加入FITC-IL-17流式抗体10 μl，震荡混匀，室温避光孵育 30 min； Th17 细胞同型对照管则需要加 10 μl FITC-Ig G 单克隆荧光抗体；500 μl PBS 液重悬细胞，待测。

1.4.2 Treg细胞的检测：取流式细胞仪上样管；每管加入 APC-CD4、FITC-CD25、PE-Foxp3各10 μl；每管加 APC-lg G1，FITC-Ig G1、PE-Ig G1 各 10 μl(作为对照管)，其中这三种流式抗体分别做一个单个抗体对照，以便于流式上机检测时补偿的调节； 加入 100 μl 抗凝全血，于漩涡震荡仪上振荡 2～5 s混匀，避光室温作用 30 min后加入 500 μl 溶血剂，振荡混匀，放置 37 ℃水浴箱中孵育 15 min； 待管内液体透明后，以 800 r/min 离心 5 min，然后将上清倒掉后加入 500 μl PBS 重悬细胞，待测。

1.5 实时定量PCR(RT-PCR) RT-PCR检测技术用于检测PBMCs中细胞对应的转录因子。Th17细胞检测IL-17，而Treg细胞检测Foxp3。

2 结果

2.1 外周血PBMCs中Th17和Treg细胞比例 CD组患者外周血 Th17 细胞比例为(2.01±0.59)%，UC 组患者外周血 Th17 细胞比例为(4.55±0.75)%，UC组患者Th17 细胞比例明显高于CD组，差异有统计学意义(P<0.05)。

Treg细胞：CD组外周血Treg细胞比例为(6.08±2.10)%，UC组为(3.27±0.97)%， CD组Treg细胞比例明显高于UC组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 两组患者PBMCs中IL-17和Foxp3 mRNA水平变化 UC组IL-17 mRNA 水平约是CD患者的4.5倍，而UC组Foxp3 mRNA水平约是CD组的0.4倍， 差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

IBD是典型的消化系统疾病，临床表现是腹泻、黏液脓血便、腹痛、里急后重等。90%以上患者都有腹泻，轻者每日排便3～4次或腹泻与便秘交替，重者每日可达10～30次。且反复发作，属慢性疾病。

IBD是一种诱因以及致病因素迄今尚且未完全阐明的肠道炎症性疾病。近年来，越来越多的研究认为，免疫调节紊乱、基因遗传是致病和发病机制的因素之一，但是免疫异常诱因在各种研究中占有重要地位。Th17细胞参与了系统免疫紊乱发生过程，Th17细胞和Treg细胞数量和(或)功能的相互作用(变化及转化)可能是IBD的致病、发病的罪魁祸首[10-11]。Th17与Treg细胞的失衡这一新的发现，给我们带来了治疗IBD的新靶点，我们可以通过各种干预手段把Th17/Treg细胞进行权重配比以达到最初无炎症时的平衡状态，从而达到预防与治疗的作用。其实，这已成为了研究的热点，也是未来发展新方向。

不过，由于体内环境错综复杂，所以在这个层面上还有很多亟待解决的问题，如在体内消减Treg细胞的安全方法、在体内的相互影响机制及操作稳定性等。因此，我们仍需对Th17/Treg细胞进行更深入的研究，从而为IBD预防和治疗提供新的思路。

[1]薛林云, 欧阳钦, 黄中华, 等. 近20年中国IBD研究进展--20年文献总结[J]. 国际消化病杂志, 2013, 33(4): 276-278.

[2]APDW2004 Chinese IBD Working Group. Retrospective analysis of 515 cases of Crohn's disease hospitalization in China: Nationwide study from 1990 to 2003 [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2006, 21(6): 1009-1015.

[3]Ek WE, D’Amato M, Halfvarson J. The history of genetics in inflammatory bowel disease [J]. Ann Gastroenterol, 2014, 27(4): 294-303.

[4]Lees CW, Satsangi J. Genetics of inflammatory bowel disease: implications for disease pathogenesis and natural history [J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2009, 3(5): 513-534.

[5]Abdulahad WH, Stegeman CA, Limburg PC, et al. Skewed distribution of Th17 lymphocytes in patients with Wegener's granulomatosis in remission [J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(7): 2196-2205.

[6]Komiyama Y, Nakae S, Matsuki T, et al. IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis [J]. J Immunol, 2006, 177(1): 566-573.

[7]刘雪平, 王轶, 赵治彬, 等. 炎症性肠病患者外周血Th17细胞的变化及其临床意义[J]. 胃肠病学, 2010, 15(5): 284-287. Liu XP, Wang Y, Zhao ZB, et al. Changes of peripheral Th17 cells and its clinical significance in patients with inflammatory bowel disease [J]. Gastroenterology, 2010, 15(5): 284-287.

[8]Fujino S, Andoh A, Bamba S, et al. Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease [J]. Gut, 2003, 52(1): 65-70.

[9]中华医学会消化道学分会炎症性肠病协作组. 对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J]. 胃肠病学, 2007, 12(8): 488-495.

[10]Abegunde AT, Muhammad BH, Bhatti O, et al. Environmental risk factors for inflammatory bowel diseases: evidence based literature review [J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(27): 6296-6317.

[11]Bernardazzi C, Pêgo B, de Souza HS. Neuroimmunomodulation in the gut: focus on inflammatory bowel disease [J]. Mediators Inflamm, 2016, 2016: 1363818.

(责任编辑：陈香宇)

A comparative study of the peripheral blood Th17 and Treg cells in Crohn’s disease and ulcerative colitis

SHANG Rui1, WU Jun1, ZHENG Xuejiao2, LU Guangxin1, YANG Yanguo1

1.Department of Gastroenterology; 2. Department of Pharmacy, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

Objective To observe the levels of Th17 and Treg cells and the expression of IL-17 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of Crohn’s disease(CD) and ulcerative colitis(UC), to investigate the role of Th17 and Treg in the mechanism of UC and CD.Methods One hundred patients with IBD including 50 cases of UC and 50 cases of CD were selected from Jan. 2014 to Dec. 2015. The Th17 and Treg cells proportion in peripheral blood were detected by flow cytometry instrument technology and expressions of IL-17 and Foxp3 mRNA in two groups were decteted by real-time PCR technology.Results The proportion of peripheral blood Th17 cells was (2.01±0.59) % in CD group, (4.55±0.75)% in UC group,there was significantly different between two groups(P<0.05). The proportion of peripheral blood Treg cells was (6.08±2.10)% in CD group, (3.27±0.97) % in UC group, there was significantyly different between two groups (P<0.05). The level of IL-17 mRNA in UC group was about 4.5 times of CD group; and the level of Foxp3 in UC group was about 0.4 times of CD group. There were significant differences (P<0.05).Conclusion The proportions of Th17 and Treg cells in UC and CD have significant differences. This can provide a new clinical diagnostic method for UC and CD, and improve the diagnosis accuracy of UC and CD.

Inflammatory bowel disease; Ulcerative colitis; Crohn’s disease; Th17 cell; Treg cell; IL-17

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.021

尚瑞，硕士，主治医师，研究方向：消化系统肿瘤基础与临床相关研究。E-mail: shangree@126.com

吴军，硕士，主治医师，研究方向：消化系统肿瘤基础与临床相关研究。E-mail: shangrkd@qq.com

R574.62

A

1006-5709(2017)05-0559-03

2016-08-23