Toll样受体7激动剂在肝脏疾病中的研究

郭素倩 李燕妮 张 瑜 王国林*

天津医科大学总医院麻醉科1(300052) 消化科2

Toll样受体7激动剂在肝脏疾病中的研究

郭素倩1李燕妮2张 瑜1王国林1*

天津医科大学总医院麻醉科1(300052) 消化科2

Toll样受体7(TLR7)是参与固有免疫的一类重要蛋白分子，也是连接固有免疫与适应性免疫的桥梁。TLR7被激活后可通过不同信号通路对肝脏疾病产生作用。近年TLR7激动剂在肝脏疾病中的研究和应用不断增多。本文就TLR7激动剂在不同肝脏疾病中的研究进展作一综述。

Toll样受体7； 激动剂； 肝疾病； 免疫

Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一种胞内具有保守Toll/IL-1受体(TIR)结构域和胞外富含亮氨酸重复序列的膜结合蛋白，目前已鉴定出10种人TLR。TLR家族主要识别多种保守的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)并与其结合，这一刺激信号可引起机体防御基因表达。TLR按所在部位主要分为两类：表达于细胞表面的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6，能识别细菌和真菌细胞壁成分以及一些病毒蛋白；表达于细胞内涵体上的TLR3、TLR7、TLR8、TLR9，主要功能是识别一些病毒核酸。TLR10位于细胞内，与TLR1、TLR2、TLR6协同发挥作用，但具体功能机制尚未明确[1]。目前研究表明TLR7信号通路在病毒性肝炎和肝癌等肝病中均有一定作用。TLR7所在的内涵体为其提供了一个无机体DNA存在的环境，避免了自我识别的不利影响。常见的TLR7激动剂包括咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)、艾沙托立宾(isatoribine)、PF-4878691、ANA773、7-thia-8-oxo-guanosine(TOG)、溴匹立明(bropirimine)、多聚尿苷酸(polyU)、U1小核RNA(U1snRNA)等。活化的TLR7主要通过三条信号通路识别配体：干扰素(IFN)通路、NF-κB通路和AP-1通路。当刺激信号不同时，TLR7激动后在不同细胞和不同疾病中发挥作用的信号通路不同，产生作用效果不尽相同[2-3]。本文就TLR7激动剂在不同肝脏疾病中的研究进展作一综述。

一、TLR7在病毒性肝炎中的研究进展

调查显示，2004～2013年我国病毒性肝炎总体发病率波动较大，但无明显下降趋势[4]。其中乙型肝炎仍维持较高的发病率，丙型肝炎报告例数逐年增加，在病毒性肝炎所占构成比逐年升高。两种肝炎的预防和治疗仍是需要攻克的难题，而病毒性肝炎的预后与病毒清除密切相关，因此，提高免疫系统清除病毒的能力具有重要意义。

病毒感染的防御依靠固有免疫和适应性免疫系统共同作用。固有免疫系统利用惟一的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)来识别异己，适应性免疫则利用特异性抗原识别受体识别异己[5]。然而HBV和HCV可逃避宿主免疫系统的攻击，从而导致慢性持续性感染[6]。为防止两种病毒感染引起的长期慢性并发症，提升保护性免疫非常重要。目前已证实IFN对乙型肝炎和丙型肝炎患者有确切疗效。给予TLR7激动剂可放大下游干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的作用[7]。

固有免疫系统是人体防御的第一道防线，可为增强高效病原的固有免疫反应做准备。固有免疫的有效启动有赖于抗原呈递，而这一过程主要由位于抗原呈递细胞(antigen presenting cells, APCs)的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)完成。此外，需联合刺激和呈递附属信号通路，其中包括诱导固有免疫系统启动的细胞因子和(或)共刺激信号通路(如TLR7信号通路)。

人体内发挥抗原呈递作用的主要细胞为树突细胞(DC)。固有免疫系统取决于DC，又受到不同TLR信号通路的介导。TLR7主要表达于浆细胞样树突细胞(pDC)，在骨髓DC(mDC)中亦有少量表达，不同的DC亚群识别病原菌后可通过不同的TLR通路传递不同信号。DC进入淋巴结后，位于DC的MHC分子与T细胞表面的多肽受体结合，诱导原始T细胞分化为效应T细胞，继而表达于DC的共刺激分子CD80和CD86，与位于T细胞的共刺激分子CD28相互作用，使效应T细胞分化并产生细胞因子以及特异性细胞毒性反应[8-10]。肝脏pDC可通过TLR7上调共刺激分子CD40、CD80、CD86。具体来说，病毒ssRNA被pDC吞噬运输形成PAMP，位于内涵体的TLR7激活该信号通路，产生特异性细胞因子和共刺激分子进而增强特异性免疫。由此可见，TLR7通路可通过产生细胞因子来促进T细胞分化。

TLR7激动剂经胃肠黏膜吸收后通过门静脉循环入血，TLR7结合配体后发生二聚体化，随后TIR与髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)特异性结合。MyD88可激活一系列特异性信号分子包括IL-1R相关激酶(IRAK)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、TNFR相关分子6(TRAF6)和转化生长因子β活化激酶(TAK-1)，上述信号分子活化后激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)、NF-κB和干扰素调节因子7(IRF7)。TLR7激动后主要激活IRF7，有利于产生抗病毒的细胞因子，包括Ⅰ型和Ⅱ型IFN[11-12]。IFN-α可促进ISGs相关产物的增加，有利于抑制肝脏病毒的复制。虽然尚未明确IFN-α抑制病毒的机制，但在肝炎不同阶段(病毒翻译和组装)均已证实其与ISGs有关[12-13]。在淋巴细胞中，TLR7刺激成熟DC产生IL-12，促进T细胞向Th1细胞分化，引起细胞毒性T细胞(CTL)反应[14]。IFN-α和CTL通过关闭病毒组装和杀灭病毒感染肝细胞，共同抑制病毒性肝炎的发展。

研究[15]表明艾沙托立宾在治疗HCV基因1型患者和非HCV基因1型患者中均表现出良好的患者可接受性和病毒清除能力，且病毒清除能力呈剂量依赖性。另一种药物瑞喹莫德与IFN-α合用可导致一些不良反应，如发热、头痛、寒战、淋巴细胞减少等[16]。PF-4878691亦表现出剂量依赖性的病毒清除能力[17]。ANA773是第一种口服TLR7激动剂，抗病毒反应与诱导剂量相关，可使血清HCV RNA水平显著下降但并不引发全身不良反应[18]。HBV病毒核酸为脱氧核糖核酸，可绕过IFN通路，但通过给予TLR7激动剂可使IFN-α重新发挥作用。GS-9620是TLR7选择性口服激动剂，可长时间抑制血清和肝脏中HBV DNA[19]。TLR7激动剂免疫调节剂可使抗病毒治疗的疗程更短，治疗成本更低。

二、TLR7在肝癌中的研究进展

研究发现，pDC是TLR7激动剂发挥基础抗病毒作用的重要免疫细胞。TLR7激活后pDC分泌细胞因子活化的其他效应细胞如NK细胞和T细胞，亦是TLR7激动剂作为免疫调节剂影响肿瘤发生的重要环节。

通过TLR7激动剂刺激，pDC和mDC分泌的IFN-α和IL-12可诱导增强NK细胞的细胞毒性作用并诱导产生IFN-γ。刺激后的NK细胞无论在体内还是体外，对肝癌细胞的清除能力均有所提升[20]。TLR7激动剂可增强NK细胞杀伤力，或许会成为治疗肝细胞癌的一种免疫调节药物。

T细胞被认为是TLR7激动剂应用于癌症模型治疗的终效应细胞。TLR7激动后产生的IFN-α可诱导间皮瘤产生抗原特异性CD4+和CD8+T细胞。被诱导分化的T细胞产生IFN-γ，增强CD8+T细胞对抗肿瘤的细胞毒性反应[21]。肿瘤组织中CD4+T细胞对TLR7激动剂治疗癌症的作用目前尚未明确。TLR7激动剂作用后，CD4+T细胞会向Th1细胞转化，鉴于Th1细胞在免疫系统中的作用，CD4+T细胞可能在其中亦起有重要作用[22]。

TLR7激动剂激活B细胞的过程类似于CD40介导的B细胞活化，涉及c-Jun、p38蛋白激酶和NF-κB。上调MHC-Ⅱ、IL-6和TNF-α均可刺激B细胞产生抗体。研究[23-24]提示，B细胞活化受IFN通路影响。虽然B细胞对TLR7激动剂的反应效率较高，但对肿瘤的治疗作用似乎尚不明显。

TLR激动剂可增强免疫系统功能和增加杀伤肿瘤细胞的特点已得到广泛共识，目前多种TLR激动剂已应用于临床试验。然而，最近发表的关于TLR激动剂治疗癌症的研究结果令人失望，且不良反应较多。有研究[25-26]指出，在胰腺癌和肺癌细胞中TLR7的表达有助于癌细胞生长。在肝癌细胞中，TLR7过表达与肝癌细胞增殖和扩散密切相关，而TLR7抑制剂通过Akt通路对肿瘤生长有一定抑制作用[27]。虽然TLR7激动剂局部应用于皮肤癌具有良好效果[28]，但如何应用于肝细胞癌仍是一个需要攻克的问题。

三、TLR7在其他肝脏疾病中的研究进展

以往认为TLR7可能与胆管闭锁相关。Huang等[29]利用TLR7激动剂咪喹莫特诱发了Balb/c新生小鼠萎缩性胆囊、肝内胆管缺乏的胆管系统发育不全，肝脏中TLR7及其下游分子IRF7、IFN-α和TNF-α表达升高。应用TLR7激动剂后肝细胞凋亡增多。说明TLR7可能与新生儿肝胆管损伤有关，可能是新生儿胆汁淤积如胆管闭锁的发病机制。

TLR7可调节Ⅰ型IFN的生成，而IFN可用于抗纤维化，但具体机制仍未阐明。Roh等[30]应用野生型、TLR7缺陷型和IFN-α/β受体1(IFNAR1)缺陷型小鼠制备肝纤维化动物模型并观察TLR7信号通路的变化。结果显示TLR7缺陷型和IFNAR1缺陷型小鼠较野生型小鼠更易发生肝纤维化，说明TLR7-IFN信号通路对肝纤维化有保护作用。值得注意的是，与野生型小鼠相比，TLR7缺陷型和IFNAR1缺陷型小鼠的IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)表达受到抑制，给予重组IL-1ra后可减少肝纤维化。在小鼠体内应用R848激活TLR7可增加肝脏IFNA4和IL-1ra的表达。此外，R848激活TLR7后可抑制促炎因子的产生，而这些效应依赖于Ⅰ型IFN信号通路。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是除外酒精和其他明确肝损害所致的以肝细胞脂肪病变为主的病理综合征。疾病初期脂质在肝脏中蓄积，巨大的脂质堆通过各种可能的机制扰乱肝功能，可发展为伴有炎症和纤维化的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFLD的发病机制仍未完全阐明，治疗效果不太令人满意。Kim等[31]的研究证实了TLR7在NAFLD中的关键性作用。咪喹莫特激活TLR7信号通路诱发自噬以及肝细胞释放胰岛素样生长因子(IGF)-1。不饱和脂肪酸(UFA)诱发的脂质堆积可被激活的TLR7通路和自噬反应减轻。TLR7的激活还减少了由UFA所导致的脂质过氧化物产生如丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)。为阐明TLR7与脂质过氧化反应之间的通路，该研究以MDA和4-HNE处理肝细胞，结果显示通过抑制TLR7诱导的IGF-1释放，UFA引起的脂质堆积作用放大了2倍，与敲除TLR7基因小鼠的体内实验结果相符。说明咪喹莫特可能成为NAFLD的治疗新策略。

TLR激动剂可用于肝脏疟原虫感染的治疗，Chen等[32]的研究于疟原虫感染小鼠前24 h分别给予TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9激动剂，结果显示TLR2、TLR3、TLR4、TLR9激动剂组血液和肝脏的疟原虫负荷量与对照组相比分别减少58%、63%、75%、88%，TLR5和TLR7激动剂组疟原虫负荷量有所减少，但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

Bagnoli等[33]的研究结果显示，小分子TLR7激动剂SMIP.7-10-Al (OH)3与疫苗抗原结合后注射至感染金黄色葡萄球菌的小鼠体内，可有效清除Mu50、Newman、LAC和MW2菌株，IgG抗体滴度明显增加，15 d生存率有所提升。这种预防疫苗对于金黄色葡萄球菌所致的肝脓肿是否有效有待证明。TLR7激动剂预处理小鼠可减少脓毒症死亡率，但对肝脏的影响尚不明确[34-35]。TLR7激动剂咪喹莫特已作为药物局部应用于成人外生殖器和肛周尖锐湿疣。

总之，目前肝脏中TLR7的相关研究较为多见，多数与病毒性肝炎和肝癌有关。TLR7激动剂对于病毒性肝炎确有疗效，但具体机制不明。TLR7激动剂对肝癌是否有效仍未有统一结论。对TLR7在其他肝脏疾病中的研究虽有所涉及，但其作用尚待进一步明确。TLR7的激活可引起机体产生一系列免疫反应，作为一种小分子免疫调节药物，TLR7激动剂在肝脏疾病中的作用有巨大的研究空间。

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(2016-09-01收稿；2016-11-08修回)

Research on Toll-like Receptor 7 Agonist in Liver Diseases

GUOSuqian1,LIYanni2,ZHANGYu1,WANGGuolin1.

1DepartmentofAnesthesiology,2DepartmentofGastroenterologyandHepatology,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin(300052)

WANG Guolin, Email: wang_guolin@hotmail.com

As an important protein molecule for innate immunity, Toll-like receptor 7 (TLR7) is also a bridge between innate immunity and adaptive immunity. When TLR7 is activated, it can exert its effect on liver diseases through different signaling pathways. Studies on the role and application of TLR7 agonist in liver diseases are increasing in recent years. This article reviewed the research on TLR7 agonist in liver diseases.

Toll-Like Receptor 7; Agonist; Liver Diseases; Immunity

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.04.013

*本文通信作者，Email: wang_guolin@hotmail.com