二氢杨梅素固体脂质颗粒抗氧化及抑菌性研究

王亚男，吴 春

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150076)

二氢杨梅素固体脂质颗粒抗氧化及抑菌性研究

王亚男，吴 春

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150076)

通过对羟自由基、超氧阴离子、DPPH清除能力和还原力的测定，确定了二氢杨梅素固体脂质颗粒的抗氧化能力；滤纸片法测定了二氢杨梅素固体脂质颗粒对细菌和霉菌抑菌性能.结果表明,二氢杨梅素固体脂质颗粒较二氢杨梅素的DPPH清除作用略高，二氢杨梅素固体脂质颗粒的羟自由基体系清除作用高于二氢杨梅素、Vc的清除作用，当质量质量浓度为0.08 mg/mL时对于超氧阴离子的清除率可达到80.89%，二氢杨梅素固体脂质颗粒与Vc的还原力接近，抑菌试验结果显示，二氢杨梅素固体脂质颗粒对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果，对青霉和黑曲霉抑菌效果不明显，对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的平均抑菌直径分别为14.1 mm和12.4 nm；对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉的最小抑菌质量浓度分别是7.5、15、60 mg/mL，对黑曲霉几乎无抑制作用.

二氢杨梅素；固体脂质颗粒；抗氧化性；抑菌性

二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DMY)又名双氢杨梅素、蛇葡萄素等，是双氢黄酮醇化合物.二氢杨梅素具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌等生物活性，且无毒副作用[1-2]，因此在日用化学工业、医药工业、食品工业以及其他领域获得了极为广泛的应用[3-5].但由于二氢杨梅素的化学结构特点，其水溶性较差；且易发生氧化，稳定性较差，使其在水溶性体系中的应用受到限制.为改善二氢杨梅素的水溶性，作者以二氢杨梅素为原料，硬脂酸与卵磷脂为载体，采用高温乳化-低温固化的方法将其制备成O/W型的固体脂质颗粒(SLP).本文在此基础上研究二氢杨梅素固体脂质颗粒的抗氧化和抑菌活性，为扩大其应用范围提供有益的实验依据.

1 仪器与材料

1.1 仪器

FA2004N电子天平、pH-2S(数显)pH计、HH.S11-2数显式电热恒温水浴锅、721E型紫外可见分光光度计、LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器、PC-1000数显式电热恒温水浴锅、LRH-70生化培养箱、DHP-9162电热恒温培养箱、SW-CJ-IFD型超净工作台.

1.2 材料

二氢杨梅素固体脂质颗粒：实验室自制.

邻苯三酚(上海第二化学试剂厂)、DPPH(美国Sigma公司)、Tris(上海科兴技术有限公司)、抗坏血酸(上海科兴技术有限公司)、青霉素钠(上海晶纯生化试剂股份有限公司)、牛肉膏(北京奥博星生物技术有限责任公司)、蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司)、琼脂粉(哈尔滨新春化工厂)，其他试剂均为分析纯.

实验菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉、黑曲霉(哈尔滨商业大学食品工程学院微生物实验室培养并提供).

2 试验方法

2.1 二氢杨梅素固体脂质颗粒抗氧化性能的测定

2.1.1 DPPH自由基的清除作用

用无水乙醇溶液配制成20 μg/mL的DPPH乙醇溶液，保存于暗处备用[6-7].取五只25 mL容量瓶，将二氢杨梅素固体脂质颗粒用无水乙醇分别配制成质量浓度梯度为0.005、0.01、0.02、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 mg/mL的二氢杨梅素固体脂质颗粒乙醇溶液.量取2 mLDPPH乙醇溶液，2 mL的样品溶液在具塞试管中混合，在室温下暗处反应30 min后，在517 nm处测其吸光值，平行3次，作为Ai；量取2 mLDPPH乙醇溶液，2 mL的无水乙醇溶液在具塞试管中混合，在室温下暗处反应30 min后，在517 nm处测其吸光值，平行3次，作为A0；量取2 mL无水乙醇溶液，2 mL的样品溶液在具塞试管中混合，在室温下暗处反应30 min后，在517 nm处测其吸光值，平行三次，作为Aj；计算公式如下：DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%.以上吸光值均以无水乙醇作参比.同样方法测得二氢杨梅素、Vc的对DPPH的清除作用.结果见图1.

2.1.2 对羟自由基体系的清除作用[8]

取5只试管，分别加入10 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1.0 mL，10 mmol/L的FeSO41.0 mL，混匀，再加入质量浓度梯度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的二氢杨梅素固体脂质颗粒乙醇溶液，加入1 mmol/L的H2O21.0 mL启动反应，用蒸馏水将体系补至10 mL，37 ℃保温30 min，于510 nm处测定吸光值，按照下列公式计算不同质量浓度的二氢杨梅素固体脂质颗粒对于羟自由基的清除率P，平行3次，计算公式如下：P=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%.其中A0为空白对照即用乙醇代替样品溶液的吸光值；Ai为加入样品后的吸光值；Aj为不加入水杨酸的吸光值.同样方法测得Vc、二氢杨梅素的对清除率.结果见图2.

2.1.3 对超氧阴离子自由基体系的清除作用[9]

取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH= 8.2)5 mL，加入1 mL质量浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mg/mL样品溶液混匀后于25 ℃水浴中反应10 min，加入10 mmol/L的邻苯三酚溶液(用10 mmol/L的HCl配制)0.5 mL，迅速混匀，320 nm处测定吸光值，每30 s读取1次，4 min后结束，样品的邻苯三酚氧化速率由吸收率曲线(ΔAi)的斜率计算.空白对照组以1 mL的蒸馏水代替样品(ΔA0)进行测定.样品本底组以0.5 mL的蒸馏水代替10 mmol/L的邻苯三酚溶液(ΔAj)进行测定.以上实验均平行3次.计算公式P：超氧阴离子清除活性(%)=[1-(ΔAi-ΔAj)/ΔA0]×100%，同样方法测得Vc、二氢杨梅素的对超氧阴离子的清除作用.结果见图3.

2.1.4 还原能力的测定[10]

取5支试管，分别加入质量浓度梯度为0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 mg/mL的二氢杨梅素固体脂质颗粒水溶液，加入0.2 mol/L磷酸盐缓溶液(pH=6.6)2.5 mL和1%铁氰化钾溶液(K3Fe(CN)6)2.5 mL 置于50 ℃水浴20 min后快速冷却，再加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的速度离心10min后取5mL上清液，依次加入4 mL蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液(FeCl3)1 mL，充分混匀后静置10 min，以蒸馏水作参比溶液，在700 nm下测定其吸光度值，吸光值越高说明还原力越强.同样方法测得Vc、二氢杨梅素的还原力.结果见图4.

2.2 抑菌实验

2.2.1 菌种悬液的配制

细菌：在无菌操作台上，取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌斜面各一支，用接种环将菌苔轻轻刮下，接入灭过菌的细菌液体培养基中，振荡均匀，将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液置于37 ℃的培养箱中培养24 h，备用.

霉菌：在无菌条件下，将青霉、黑曲霉分别用接种环接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基后，于28℃培养箱中培养.培养3 d后，待菌落成熟后，取适量的灭过菌的生理盐水倒于其上，用无菌玻璃棒将菌落刮下，置于已灭菌的三角瓶中，振荡摇匀，再用无菌8层纱布过滤，即得霉菌孢子悬液，备用.

2.2.2 配制培养基

细菌培养基：于1 L蒸馏水中加入蛋白胨10 g，准确称取的牛肉膏3 g，氯化钠5 g，边加热边用玻璃棒搅拌使其充分溶解，然后分装到锥形瓶中，加塞，121 ℃高压灭菌20 min(固体培养基另加 15～20 g的琼脂).

霉菌培养基：马铃薯300 g(马铃薯去皮，洗净，切成小块)，放入1 000 mL水中煮沸20 min，双层纱布过滤，得马铃薯汁，再加琼脂20 g，煮沸溶解，趁热加20 g葡萄糖，并补足水分到1 000 mL，分装，于121 ℃高压灭菌20 min.

2.2.3 抑菌圈测定

将滤纸用直径6 mm的打孔器打成6 mm的圆片，经高压灭菌处理后，置100 ℃烘干，保存备用.在无菌超净台中，每个灭菌后平板中加入大约20 mL的45 ℃左右的未凝固培养基，放在超净台的水平位置待其凝固后使用一次性注射器取菌种悬液100 μL于平板的中心处，用涂布棒将其在整个平板中涂布均勾.将滤纸浸泡在无菌水、青霉素钠、二氢杨梅素固体脂质颗粒(30 mg/mL)溶液30 min以上.取出分别贴在1～6﹟培养基中.每种溶液做3次水平实验.平板封口后，放入培养箱中倒置培养.细菌(大肠、枯草)放于37 ℃的培养箱中培养24 h.霉菌放于28℃培养箱中培养霉菌48 h.毫米刻度尺测量抑菌圈直径，并记录，结果见表1、2.

2.2.4 最低抑菌质量浓度(MIC)检测

采用两倍稀释法[11-13].根据体外抑菌实验结果并结合提取物的溶解性，测定二氢杨梅素固体脂质颗粒的最低抑菌质量浓度.将其配成120 mg/mL的质量浓度备用，取无菌试管10支，每管加入适宜的培养基20 mL，分别加入120、60、30、15、7.5、3.75 mg/mL的二氢杨梅素固体脂质颗粒溶液1 mL，混合均匀倾入平皿，培养基凝固后，将0.1 mL稀释后的菌悬液加入平皿中并涂匀，将细菌于37 ℃下培养24 h，霉菌于28 ℃下培养48 h，而后观察结果.MIC表示不长菌的稀释溶液的质量浓度.结果判定：以肉眼观察，不发生混浊变化的最高提取物稀释倍数为该提取物的MIC，结果见表3.

3 结果与讨论

3.1 二氢杨梅素固体脂质颗粒抗氧化活性测定的结果与分析

3.1.1 对DPPH的清除作用

二氢杨梅素固体脂质颗粒(SLP)、二氢杨梅素(DMY)和Vc对DPPH的清除作用结果如图1所示.二氢杨梅素、二氢杨梅素固体脂质颗粒及Vc对DPPH的清除率均随其质量浓度的增加而增大，三者均有较好的清除效果，快速的达到平衡，清除能率依次为Vc>二氢杨梅素固体脂质颗粒>二氢杨梅素，其中Vc的清除效果最好.结果表明，二氢杨梅素固体脂质颗粒的DPPH清除能力较二氢杨梅素略高，二氢杨梅素固体脂质颗粒有利于其抗氧化能力的发挥.

图1 二氢杨梅素固体脂质颗粒(SLP)对DPPH的清除作用

3.1.2 对羟自由基体系的清除作用

采用水杨酸法测定不同质量浓度二氢杨梅素固体脂质颗粒(SLP)、二氢杨梅素(DMY)及Vc溶液对羟自由基的清除率结果如图2所示.二氢杨梅素、二氢杨梅素固体脂质颗粒及Vc对羟自由基的清除率均随样液质量浓度的增加而增大.由于黄酮类化合物有活泼的3，4位酚羟基，能提供活泼的氢离子，从而阻断自由基反应，二氢杨梅素固体脂质颗粒的清除效果一直高于Vc.当质量浓度大于0.8 mg/mL后，Vc的羟自由基体系的清除作用高于二氢杨梅素.结果表明，二氢杨梅素和二氢杨梅素固体脂质颗粒均对羟自由基有一定的清除能力，而以硬脂酸与卵磷脂作为载体制备的二氢杨梅素固体脂质颗粒在一定程度上增强了二氢杨梅素的抗氧化能力.

图2 二氢杨梅素固体脂质颗粒(SLP)对羟自由基的清除作用

3.1.3 对超氧阴离子自由基体系的清除作用

采用邻苯三酚法测定不同质量浓度二氢杨梅素固体脂质颗粒(SLP)、二氢杨梅素(DMY)及Vc溶液对溶超氧阴离子自由基的清除率的结果如图3所示.可以看出随质量浓度的升高，对超氧阴离子的清除能力也逐渐增大，这是由于二氢杨梅素和二氢杨梅素固体脂质颗粒的质量浓度升高，他们作为自由基的接受体，阻碍自由基连锁反应的能力也就越强，同时增强了清除自由基的能力.在质量浓度梯度为0～0.04 mg/mL中，二氢杨梅素与Vc的清除效果接近且低于二氢杨梅素固体脂质颗粒，当质量浓度大于0.04 mg/mL后，Vc的清除作用高于二氢杨梅素及其固体脂质那颗粒.实验结果表明，二氢杨梅素固体脂质颗粒及二氢杨梅素均有抗氧化能力，且二氢杨梅素固体脂质颗粒的清除能力较二氢杨梅素强.

图3 二氢杨梅素固体脂质颗粒(SLP)对超氧阴离子的清除作用

3.1.4 二氢杨梅素固体脂质颗粒的还原能力

采用铁氰化钾还原法测定不同质量浓度二氢杨梅素固体脂质颗粒(SLP)、二氢杨梅素(DMY)及Vc溶液的还原能力结果如图4所示.可以看出，在0.06～0.1 mg/mL质量浓度范围内，二氢杨梅素、二氢杨梅素固体脂质颗粒及Vc的还原能力都随质量浓度的升高而增强，抗坏血酸的还原能力最强，二氢杨梅素固体脂质颗粒次之，且二氢杨梅素固体脂质颗粒与Vc的还原能力相近.

图4 二氢杨梅素固体脂质颗粒(SLP)的总还原能力

3.2 二氢杨梅素固体脂质颗粒的抑菌活性的结果与分析

3.2.1 对细菌的抑菌效果

见表1.

表1 二氢杨梅素固体脂质颗粒对大肠杆菌的抑菌效果

3.2.2 对霉菌的抑菌效果

二氢杨梅素固体脂质颗粒及青霉素钠均未在涂有黑曲霉的平皿上出现抑菌圈，说明二氢杨梅素固体脂质颗粒对黑曲霉没有抑菌作用，二氢杨梅素固体脂质颗粒及青霉素钠在涂有青霉的平皿中只有滤纸片粘贴处无菌生长，说明二氢杨梅素固体脂质颗粒对青霉抑制作用不明显.

3.2.3 最小抑菌质量浓度(MIC)的测定结果

见表2.

表2 二氢杨梅素固体脂质颗粒最小抑菌质量浓度(MIC)的测定结果

注：“-”：无菌生长；“+”：菌落生长

4 结 语

实验以二氢杨梅素和Vc作为对照，对二氢杨梅素固体脂质颗粒的抗氧化性进行了研究，主要测定其对DPPH、羟基自由基、超氧阴离子和还原能力.二氢杨梅素固体脂质颗粒的清除能力虽比Vc略低但较二氢杨梅素有了明显的提高，且清除能力随着质量浓度的增加而提高.当质量浓度达到0.1 mg/mL时对DPPH的清除率最高达到81.77%，当质量浓度为0.6 mg/mL时对羟自由基的清除作用超过Vc，当质量浓度为0.08 mg/mL时对于超氧阴离子的清除率就可达到80.89%，二氢杨梅素固体脂质颗粒的还原力高于Vc.

实验以无菌水、二氢杨梅素、和青霉素钠做对照，研究了二氢杨梅素固体脂质颗粒对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉和黑曲霉这四种菌的抑制效果.结果表明二氢杨梅素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，对青霉、黑曲霉无明显的抑制作用，二氢杨梅素固体脂质颗粒对四种菌中的具体抑制效果如下：1)二氢杨梅素固体脂质颗粒对大肠杆菌草芽芽孢杆菌和的平均抑菌分别为14.1 mm和12.4 nm；对青霉和黑曲霉抑制效果较弱，说明二氢杨梅素固体脂质颗粒对细菌抑制效果显著.2)二氢杨梅素固体脂质颗粒的最小抑菌质量浓度：二氢杨梅素固体脂质颗粒对细菌的抑制作用较明显，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉的最小抑菌质量浓度分别是7.5、15、60 mg/mL，对黑曲霉几乎无抑制作用.

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Study on antioxidant and antibacterial activity of solid lipid particles of dihydromyricetin

WANG Ya-nan, WU Chun

(School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The antioxidant capacity of dihydromyricetinsolid lipid particles was determined through hydroxyl free radical, superoxideanion, DPPH scavenging capacity and reducing power assay. The antibacterial properties of bacteria and molds of dihydromyricetinsolid lipid particles were measured using filter paper method. The optimized conditions were obtained as follows. The scavenging effect of DPPH on dihydromyricetinsolid lipid particles was higher than that of dihydromyricetin. The scavenging effect of hydroxyl radical system of dihydromyricetinsolid lipid particles was higher than that of Vc and dihydromyricetin. When the concentration was 0.08 mg/mL, the scavenging rate of superoxide anion could reach 80.89%, and the reduction force of dihydromyricetinsolid lipid particles was close to Vc. The results of antibacterial test showed that dihydromyricetinsolid lipid particles had obvious antibacterial effect on E. coli and Bacillus subtilis, and the average antibacterial diameter of E. coli and Bacillus subtilis was 14.1mm and 12.4 nm. The minimal inhibitory concentrations of E. coli, Bacillus subtilis and Penicillium were 7.5 mg/mL, 15 mg/mL and 60 mg/mL, respectively. It had almost no inhibitory effect on Aspergillus niger.

solid lipid particles; dihydromyricetin; antioxidant activity; antibacterial activity

2016-06-06.

王亚男(1991-)，女，硕士，研究方向：食品科学.

TS272

A

1672-0946(2017)01-0048-04