近红外光谱分析技术及其在饲料中的应用

2017-03-08李玉鹏李海花乔家运王文杰

中国饲料 2017年4期

关键词：定标光谱仪器

李玉鹏，李海花，朱琪，乔家运，王文杰*

（1.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津300381）

检测分析

近红外光谱分析技术及其在饲料中的应用

李玉鹏1，2，李海花1，2，朱琪1，2，乔家运1，2，王文杰1，2*

（1.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津300381）

近红外反射光谱分析技术（N IRS）正在以产业链的方式应用于多个领域，它可以快速高效地测定样品中的化学组分和物化性质。近年来，近红外光谱技术尤其是在线分析的应用有了显著的发展，本文就近红外光谱分析技术的原理及在饲料中的应用研究进行了介绍。

近红外反射光谱分析；饲料；检测

近红外光谱技术（NIRS）测定样品中的化学组成和物化性质时具有速度快、效率高、样品处理简单等优点（陆婉珍等，2000），近些年正在以产业链的方式应用于多个领域，如农业、石化、制药、食品和临床等，成为农工矿企业和科研部门不可或缺的一种手段。

利用经典的化学分析方法分析饲料的常规组分及营养成分，一直是饲料品质管理的主要手段，虽然灵敏度和精确度高，但仍存在样品准备繁琐、前处理复杂、分析时间较长、检测成本高、污染环境、对试验条件和操作的人员要求相对较高等问题，但近红外反射光谱技术的应用成功地解决了上述问题，随着NIRS技术的发展利用，饲料检测成为NIRS技术应用最早的领域之一。

1 近红外光谱分析技术

近红外光本质是电磁波。近红外光谱（NIR）区的发现比较早，是在1800年由Hershel发现的。美国ASTM（American Society for Testing and Materials，ASTM）规定近红外光谱范围为780～2526 nm（12820～3959 cm），介于可见光和中红外之间。普遍认为近红外波长分为两个区域，即长波和短波，780～1100 nm处为短波，常用来做透射分析，1100～2526 nm处为长波，常用来做反射或漫反射分析（董守等，2004；陆婉珍等，2000）。NIRS是20世纪70年代后发展起来的一种新的快速定性定量分析技术，尤其是进入80年代后，工业生产技术的发展十分迅速，且社会对环境保护提出了更高的要求，近红外技术为节能降耗发挥巨大作用（赵雅欣等，2005）。NIRS主要是利用有机物中含氢集团X-H（包括C-H、N-H、S-H、O-H等化学键）振动的倍频与合频吸收，振动的非谐振性分子振动从基态向高能级跃迁时产生，并通过主成分分析（priciple component analysis，PCA）、偏最小二乘法（partial least square，PLS）和人工神经网络（artificial neural network，ANN）等化学计量学手段，建立物质成分光谱与相应的待测成分含量之间的回归模型，可利用相关系数较高的预测模型和待测物质的近红外光谱信息预测物质化学成分含量（张卉等，2007）。

1.1 近红外光谱分析技术原理分子光谱的产生是由于分子中原子核的周期运动，包括近红外、中红外、远红外和拉曼光谱。近红外光谱分析技术是根据物质的光谱信息，对其进行定量或定性分析的一种技术。近红外光谱分析技术基本分为透射光谱和漫反射光谱两大类。透射光谱法常用于均匀透明的液体，固体样品较常用漫反射光谱法，在短波近红外处固体样品也可用透射光谱法。能产生近红外光谱的物质分子都是红外活性分子，非红外活性分子不吸收红外光。物质组分的浓度值与通过仪器测定的光谱之间有一定的相关性（秦华俊，2007）。由于影响近红外谱带位置变化的因素很多，因而精确近红外谱谱带的归属十分不易（陆婉珍等，2000）。近红外定量分析过程分为三部分：定标、验证和应用，而最终的目的是为了应用，发挥近红外的优势，实现其研究价值。

1.2 近红外光谱分析技术的特点近红外光谱分析技术成功地结合了计算机技术、光谱技术和化学计量学等诸多方面的技术成果，已在许多领域中得以应用，与传统分析技术相比主要具有以下优点：不需要对待分析样品进行前处理、不会对环境造成污染且节约大量的试剂费用、投资及操作成本低、分析方便速度快、稳定性好，受干扰小、分析过程中不消耗其他材料或破坏样品、测试重现性好等（陆婉珍，2006）。随着微电机系统和微光机电系统技术的发展，国内外研制出了几款新型的微型近红外仪。微型近红外光谱仪与普通的光谱仪相比有其明显的优势：（1）体积小、容易实现模块化，更符合近年来对检测仪器轻巧、便携的要求，且实现了现场应用的价值；（2）耐用、结构紧凑、低能耗、校准速度快、对环境温度和湿度变化适用范围更宽；当前，国内生产的微型化近红外光谱仪大多数还处在理论的样品机状态，实用化的商品较少，但是，也已在制药、奶粉生产等现场的监测中广泛应用，所以微型化近红外光谱仪的开发不仅是现实的需要，也是一种普遍趋势。

然而，近红外技术也存在一些缺点（张丽英等，2011；严衍禄等，2005；陆婉珍等，2000）：（1）近红外技术是一种间接测量手段，需要用参考方法（一般是湿化学分析法）得到足够数量的样品湿化学分析值，因此测量精度基本都达不到该参考方法的测量精度，同时模型建立也离不开化学计量学的支撑；（2）前期投入大、费时费力，仍需检测大量样品的湿化学值，建模成本较高，对小批量样品分析不切实际；（3）近红外技术的使用范围有一定的限制，待测定的成分含量最少为0.1%，且有含氢基团或与之含氢基团相关的属性；（4）仪器和仪器周围环境的改变或建模样品发生改变，导致模型也会发生变化，需要对定标模型进行不断的更新和优化；（5）由于不同的仪器所产生的近红外光谱并不一致，使得每台仪器的模型都不相同，模型不能在不同型号仪器之间转移，每个仪器上的模型需要随着时间和空间范围的变化不断地进行维护，从而增加了使用的局限性（李军涛，2014）。而微型近红外仪测试的灵敏度比较低、相对误差较大，分辨率和光谱稳定性还有待提高（张小超等，2012）。

1.3 近红外模型的评价参数和优劣性判断标准近红外模型的建立过程中，需要用到诸多参数（SEC、SECV和R2等）对模型的质量进行评定，以选取最优的建模参数，进而得到预测性能最佳的模型。

定标模型建立后采用交叉验证相关系数（1-VR）、交叉检验标准误差（SECV）、模型的交叉验证偏差（Bias）、定标标准分析误差（SEC）、定标决定系数（RSQcal）对其预测性能进行综合评定。1-VR值越大，SEC越小，SECV值也越小（通常SECV大于SEC）则模型回归得越好，但SEC过小，说明校正过程中可能存在过拟合现象。

在定标模型建立完成后，需要用验证集对模型的性能（准确性、重复性和传递性等）进行验证。验证集是由一组完全独立于定标集的样本组成，采用近红外预测值与湿化学值间的平均偏差（Bias）、验标标准分析误差（SEP）、验标相关系数（RSQv）及实验室实测值和近红外值进行评定。SEP越小，预测结果越准确。相关系数（RSQv）越高，同时验证集的预测值与湿化学值间的平均偏差（Bias）相对偏低的模型，即为最优模型。

1.4 影响近红外测定准确性的因素影响近红外测定准确性的因素很多，基本上可分为三大类：（1）样品本身的影响；（2）参比值测定的准确性；（3）近红外仪器的稳定性及操作环境。

1.4.1 定标样本的数量、来源、成分含量与变异试验样本数量的多少和分布影响测定结果的精确度，样本数量过少不能充分反映被测群体的整体分布规律，样本代表性差，建立的模型难以有适用性；样本数量过多，不仅增加了工作量，而且也可能造成过拟合现象的出现。在实际应用中一般认为，建立适配性较窄的模型需选择50～100个定标样品，而建立适配性较宽或面向开放未知样品群的模型则最少要选择150个以上的样品（李勇等，2005）。选择具有代表性的样品，尽可能均匀全面地覆盖整个测定组分含量范围，但也要尽量避免样品组分含量出现正态分布的现象，这样才能够充分地反映出待测样品群体常态分布规律，构建的近红外预测模型性能才更真实可用。对于棉籽粕，采集样品时除了考虑数量和成分含量、变异外，还应充分考虑品种、生长环境、加工方式、收获季节等因素（李军涛，2014）。

1.4.2 样品的物理性状粉碎粒度的大小、样品分布和密度等也会对近红外预测性能产生影响。Thompso（1978）研究表明，样品粒度是影响NIRS预测准确性最主要的因素。由于粒度不同影响样品分布均匀性和光学表面性质，所以会导致反射光分散进而改变样品的近红外光谱信息。Williams（1984）研究报道，在进行试验分析的过程中样品的水分含量应处于稳定、自然状态下，所以应注意样品的保存。为防止样品在储存过程中的水分损失，将其装于密封广口瓶或自封袋中，-18℃低温保存。样品的温度是影响近红外测定的准确性的重要因素之一，所以在扫描样品时将样品放置在近红外室内24 h，可达到平衡温度的效果，尽量保证定标样品和待测样品的光谱采集在同样温度下进行。此外，样品表面的颜色和样品中的杂质也会对模型的性能造成影响。

1.4.3 参比数据的准确性按照一定标准的湿化学方法分析得到的参比数据的准确性也是影响NIRS测定结果的重要原因之一。褚小立等（2005）研究表明，基础数据准确性越高，则建立的模型的预测性能越好，对未知样本的预测结果越精确。因此，对于定标和验证样品的理化值而言，其检测一定要按照国际公认的标准或国标法进行，且每个样品至少做2～3个平行，以确保参比值的检测结果的精准无误。

1.4.4 近红外光谱仪的稳定性和操作环境仪器对测定结果准确性的影响大部分因素来自于仪器的噪音。仪器产生的噪音分为不同形式，即长期噪音和短期噪音。长期噪音主要因环境温度变化和原件功能衰退而产生的。彭玉魁等（1996）研究表明，10～20℃的温度改变会导致样品吸光度变化，且此变化不定，无规律性。样品杯中样品的深度、密实度、装样后表面的平整度和样品杯的清洁程度等因素也会对光谱造成一定的影响。因此每次尽可能保证一样的装样条件，在相同的条件下测定样品，以大大减少误差。因此，近红外的测定一般要求在相当稳定的环境条件下工作。在进行近红外测定之前，仪器的预热很重要，且其时间与仪器的型号有关，不能短于15min或超过30min。短期噪音主要来源于波长不稳定、检出器和输入放大器及仪器外部噪音。

2 近红外光谱分析技术发展概况

人类最早认识的非可见光谱区是近红外谱区，发现于1800年（严衍禄，2005）。近红外在19世纪30年代被证明具有与可见光相同的光学性质。由于受技术水平的不发达的限制，无法解决物质在该光谱区的合频和倍频的吸收特征弱、谱带交叠严重、解析困难等因素带来的问题，因而使近红外光谱“沉睡”了长达一个半世纪的时间。随着各种技术（计算机、数字化和计量学）的不断发展，背景干扰等问题的解决，可以很好地提取有效光谱信息。近红外光谱的优势和使用价值逐渐被研究者证明，越来越多的实验室和企业正在开展近红外方面的研究，且被在实际中应用。近红外作为高新技术之一，正在迅速发展，目前世界上大约有50个国家和地区对近红外进行了相应的研究工作，尤其是一些发达国家近红外技术已在许多领域得到了实际应用（张小超等，2012）。

20世纪70年代近红外技术被美国人应用在农产品水分、蛋白质等组分含量的检测。1950年前后，应用光谱的分析仪器倍受研究人员的关注，同时也关注近红外光谱分析技术的发展情况，自1980年后应用光谱杂志（Applied Spectroscopy）上发表了很多有关近红外光谱方面的论文，论文中涵盖了有关近红外定量和定性分析（Stark等，1986）、有机物组分含量的分析（Weyer等，1985）、近红外药物成分分析和与之相关的研究进展等（Martin等，1992；Ciurczak等，1987）。近年来现代的科学技术一直在进步，微机械技术的发展以及微型光学元器件的研制成功，使得光谱仪的微小型化成为可能，并逐渐成为研究热点之一（向贤毅，2008）。许多研究人员利用新技术致力开发低成本、微型轻巧、能耗低且反应速度快的仪器，即微型近红外仪。同样，微型近红外仪也分类型，主要的有传统原理的傅里叶变换式光谱仪、光栅分光式微型光谱仪等和新原理的光谱仪。但是，整体上来说部分技术指标像分辨率、波长的准确程度和信噪比等仍然差于实验室型的分析仪。

我国近红外光谱技术的应用研究是从农业领域开始的，在1977年前后才引入近红外分析仪。国内的严衍禄、张录达等人最先研究学习近红外方面的知识，为以后近红外的应用研究打下了坚实的理论基础，且在20世纪80年代初组建了研究傅立叶变换近红外漫反射光谱的专项小组（李大群等，1989）。20世纪80年代初发表了我国第一批关与此项技术的学术研究论文（袁洪福等，2004；赵龙莲等，1998；Yan等1998；Min等，1998；吉海彦等，1998）。目前，近红外光谱分析技术已经率先广泛运用于我国纺织、造纸、生物化工、烟草、乳品、酒类与农业等行业，它在确保和提高产品品质方面发挥了重要作用（徐广通等，1999）。近年来，我国的光谱仪器的制造，化学计量学软件的研发，相关模型的构建和在实验室及企业中的应用都有了长足的发展。我国许多领域已经开始了近红外光谱在线分析的应用，对实际生产中的各种参数，每个质量控制环节实施连续监控，确保获得高质量产品（蒲登鑫等，2003；徐广通等，1990）。

3 近红外光谱分析技术在饲料中的应用

由于近红外光谱分析技术独特的优势，伴随着仪器的制造水平的提升、光谱化学计量学软件的开发及各种测定样品附件的研制均已达到较高的水平，自20世纪80年代中后期以来，NIRS在饲料中的应用已相当成熟，是农业经济快速发展的新亮点。

1960年开始，研究者Norris等（Burns等，1992）率先开始了利用NIRS测定谷物中的常规营养成分含量的研究，同时也进行了将近红外光谱技术应用于其他农产品组分和质量的研究。随着近红外光谱分析技术的熟练应用，Schaalje和Mundel（1991）利用NIRS对大豆中氮的含量进行了检测。Fontaine等（2001）研究表明，利用NIRS测定鱼粉中油脂和蛋白质含量是可行的。Montes等（2006）对饲料中的能量之王玉米的三种成分进行测定，其结果为：DM（RV2=0.95，SEP=1.2%），CP （RV2=0.88，SEP=0.3%），ST （RV2=0.79，SEP= 1.0%）。

Xiccato等（2003）采集不同国家的兔子饲料样品164个，利用NIRS对DM、CP、CF、NDF、ADF、ADL和Starch成分的含量进行测定，随机选取111个样品作为定标集，剩余53个样品作为验证集，结果表明，定标集决定系数（R2）分别为0.79、0.84、0.63、0.56、0.84、0.74、0.94，检验集决定系数（R2），分别为0.70、0.86、0.60、0.50、0.82、0.59、0.90。

李静（2007）利用NIRS成功构建了棉粕化学成分的定标模型和验证模型，模型预测棉粕粗脂肪含量的性能较差，其余常规营养成分的定标模型效果较好，可用于日常分析检测。

目前NIRS技术不局限于样品常规成分的分析，同时也能分析样品中的微量组分含量，如氨基酸、维生素、毒素等物质含量，还可以进行饲料有效能或消化率的测定等。有研究表明，近红外预测棉籽粕真可利用氨基酸含量的定标结果是可行的，可按真可利用氨基酸进行饲料配方，达到准确适时高效利用饲料资源的目的（丁丽敏，2000）。Lesson（2008）采用不同的方法测定了配合饲料和不同原料中的表观代谢能（AMEn），试验结果表明，不同测定方法得到的结果之差范围为41.8～209 kJ/kg，而用NIRS测定的AMEn与湿化学测定值之间的平均差为836 kJ/kg，远低于用其他测定方法得到的1254～1672 kJ/kg的差值，说明NIRS可以用于饲料中的AMEn的检测。Losada （2010）采用体外法、常规法和近红外法，分别对公鸡的能量饲料的AMEn进行评定，结果显示，RSQval分别为0.945、0.756和0.952。总结多数研究者的结果，表明近红外方法可用于饲料代谢能评定。

4 结语

我国的近红外光谱分析技术的研究和应用虽然起步较晚，但随着仪器和光谱处理化学计量软件的国产化和相应各类应用模型的开发，近红外光谱技术作为一种分析技术将会在越来越多的领域中充当快速检测的手段。

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Near infrared reflectance spectroscopy（NIRS）has been applied in many fields，which can determine chemical composition and physical properties of the samples quickly and efficiently.In recent years，NIRS analysis skill has been improved significantly，especial online applications.This article introduced the principle of NIRS and its application in the feed.

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