丹参多酚酸盐微生物限度检查方法的建立

张媛媛+张玥莉

摘 要 目的： 探索消除丹参多酚酸盐抑菌活性的适宜方法，并建立丹参多酚酸盐微生物限度检查方法。 方法： 参照2015年版《中国药典》四部微生物限度相关规定，分别采用薄膜滤过法、中和法、稀释法去除或灭活丹参多酚酸盐中的抗菌活性。 结果：采用薄膜过滤法，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜可将抑菌成分去除，该方法可为含中药抑菌成分药物微生物限度检查方法的建立提供参考依据。

关键词 丹参多酚酸盐 微生物限度 薄膜过滤法

中图分类号：R927.11； R286 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）03-0072-03

Establishment of a method for microbial limit test of salvianolate

ZHANG Yuanyuan1*， ZHANG Yueli2（1. Shanghai Lvgushengmingyuan Pharmaceutical Co. Ltd.； 2. Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for microbial limit test and the elimination of the antimicrobial activity in the raw materials of salvianolate. Methods： A method for removing or eliminating the antibacterial activity in the raw materials of salvianolate was tested based on the membrane filtration， neutralization and dilution methods recorded in the related regulations of Chinese Pharmacopoeia （2015 edition， Volume Ⅳ）. Results： The antibacterial active component could be removed by washing the membrane for filtration with pH 7.0 sterile sodium chloride-peptone buffer， which can provide a reference for microbial limit tests of traditional Chinese medicine containing antimicrobial active components.

KEy WORDS salvianolate； microbial limit test； membrane filtration

丹参多酚酸盐是以丹参为原料，经提取、分离、纯化等工序制备出的原料药，其主要成分为丹酚酸B。研究表明，丹酚酸B具有抗脑及心肌缺血、调节血脂代谢等作用，对冠心病、冠心病稳定型心绞痛等疾病疗效显著[1-4]。丹参多酚酸盐作为一种植物多酚物质，具有广谱的杀菌作用[5-7]，故用常规方法进行微生物限度检查时会影响微生物的生长，从而影响检查结果。药品中微生物污染的控制是药品质量控制的重要指标，2015版《中国药典》四部中提到，当供试品有抑菌活性时，应采用适宜的方法进行处理，以消除供试品的抑菌活性，并通过实验验证抗菌活性的去除是否彻底，再依法检查[8]。目前常用的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、静置法、中和剂法等，其中，薄膜过滤法是液体类制剂和抑菌作用较强的水溶性药品如抗生素类及各种滴眼、鼻、耳制剂及药酒等进行微生物限度试验的首选方法。但药典对其检查的具体操作并未明确叙述[9-11]。本研究主要探索消除丹参多酚酸盐抑菌活性的适宜方法，并建立丹参多酚酸盐微生物限度的检查方法。

1 材料和方法

1.1 实验材料

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）及pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（上海中科昆虫生物技术开发有限公司，批号分别为151130、151223、150821、150210及151225）；氯化钠（上海润捷化学试剂有限公司，批号为20150502）；金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、白色假丝酵母、黑曲霉。（中国食品药品检定研究院，批号：CMCC（B）26003-5a28-1、CMCC（B）10104-2a20-1、CMCC（B）63501-2a21-1、CMCC（F）98001-2a14、CMCC（F）98003-201507），丹参多酚酸盐（上海绿谷生命园医药有限公司，批号：150601、150602、150603）。

1.2 实验仪器

YP1002N电子天平（上海精密科学仪器有限公司），HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），PHS-3C酸度计（上海佑科仪器仪表有限公司），BSC1000ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空气技术有限公司），Talboys涡旋混合器（Henry Troernner，LLc），YX490D电动吸引器（上海医疗器械公司医用吸引器厂），spx-250BSH-Ⅱ生化培养箱和MJ-160BS-Ⅱ霉菌培养箱（上海新苗医疗器械有限公司），XK97-A菌落计数器（杭州齐威仪器有限公司），YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 菌液的制备

取经培养的铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌TSB新鲜培养物及白色假丝酵母SDB新鲜培养物按照2015版中国药典四部有关内容培养备用。

1.3.2 供试液的制备

取丹参多酚酸盐供试品10 g，加pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，混匀，制得供试液A。另取丹参多酚酸盐供试品10 g，加含3%（v/v）聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分散均匀，调节pH至7.02，然后加稀释液至100 ml，混匀，制得供试液B。

1.3.3 抗菌活性的去除或灭活方法

1）稀释法 ①试验组：取制备好的供试液A，加入试验菌液，混匀，使含菌量不大于100 cfu/ml，取1 ml菌液，等量分注于5个无菌平皿，立即倾注20 ml相应琼脂培养基，摇匀，凝固后于规定温度下倒置培养48～72 h，计数。②供试品对照组：取制备好的供试液，用稀释液代替菌液同试验组操作。③菌液对照组：取稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌并进行回收试验。④阴性对照组：以稀释液代替供试液同试验组操作，但稀释液中不加入菌液。

2）中和剂法 增加稀释剂对照组：取含3%（v/v）聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，按试验组操作加入试验菌并进行回收试验。其余同稀释法。

3）薄膜过滤法 试验组：取供试液A 9.9 ml，加入0.1 ml含菌量不大于100 cfu的菌液，混匀后，注入滤膜经润洗的开放式滤器中，加入100 ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，全量通过孔径0.45 μm混合纤维素膜后，再加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 ml冲洗，取出滤膜，菌面朝上贴于培养基上。需氧菌用TSA培养基，在30～35 ℃下培养48～72 h。霉菌和酵母菌用SDB培养基，在20～25 ℃下培养48～72 h，计数。各对照组同上。

1.3.4 计算公式

试验组比值=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数。

稀释剂对照组比值=（稀释剂对照组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数。

试验组比值和稀释剂对照组比值都应在0.5～2.0范围内。

2 结果

1）稀释法 铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的回收率分别为0.6和0.5，刚刚达到要求；金黄色葡萄球菌比值（回收率）为0，不符合要求（表1），因此并未继续进行白色假丝酵母和黑曲霉的测定。这些结果表明，稀释法并不能有效去除丹参多酚酸盐中的抑菌活性成分。

2）中和剂法 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的回收率均不能达到要求（表2），可能选择的中和剂种类不正确，无法中和丹参多酚酸盐中的抑菌活性成分。

3）薄膜过滤法 三次验证试验，试验菌的回收率均能达到药典要求，且试验组与菌液对照组的菌落形态一致，所以在试验冲洗量下，薄膜过滤法可以有效去除药品中抑菌活性成分对检测的干扰（表3、4），因此可用该法测定丹参多酚酸盐中的需氧菌、霉菌和酵母菌数。

3 讨论

微生物限度检查中多种干扰因素会影响计数结果，如培养基、培养条件、加菌量等，都需要格外注意，以最大限度地减少对实验结果准确性的干扰[12-13]。通过本次试验，成功摸索出了含有抑菌活性成分的丹参多酚酸盐的微生物限度检测方法—薄膜过滤法，同时为含有抑菌活性药品微生物限度检测方法的建立提供参考依據。薄膜过滤法可以把外界影响和操作者的主观因素减少到最低，因此该方法更为科学、客观、公正，能够全面反映样品的染菌情况[14-15]。但是该方法操作较为繁琐，而本试验中采用中和剂法又未能获得如期结果，其原因可能是没有找到合适的中和剂，所以，在以后的试验中可继续探寻是否有更合适的、能有效中和丹参多酚酸盐中的抑菌活性成分的中和剂。

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