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藏茵陈提取物抗肿瘤活性及其机理的研究进展

2017-03-07王海霞黄慧明倪芳芳曹长年��赵红平

中国民族民间医药·下半月 2017年1期
关键词:藏药

王海霞 黄慧明 倪芳芳 曹长年��赵红平

【摘要】藏茵陈是藏药中最具特色的治疗热症、肝胆病及血液病的清热解毒药,其提取物獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、齐墩果酸、熊果酸与芒果苷等有效成分含量高、毒副作用小,具有抗腫瘤活性。笔者对藏药藏茵陈提取物抗肿瘤活性及其机理的研究进展进行综述,对其潜在的癌症临床治疗方向进行展望。

【关键词】藏茵陈;藏药;抗肿瘤活性;獐牙菜苦苷

【中图分类号】R29【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2017)02-0057-05

Review of Antitumor Activities of Zangyinchen Extracts and Their Mechanisms

WANG Haixia1,2HUANG Huiming2NI Fangfang1CAO Changnian1*ZHAO Hongping2*

1. School of Chemical Engineering, Qinghai University, Qinghai 810016, China; 2. Institute of Biomechanics and Medical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Abstract:Zangyinchen is a Tibetan folk medicine with its various pharmacological effects, especially in the treat of gall bladder and liver disorders. Chemical and pharmacological studies of Zangyinchen have show that its rich bioactive constituents, amarogentin, gentiopicroside, ursolic acid and oleanolic acid, have been found to have antitumor activities with low toxicities. The author reviewed antitumor activities of Zangyinchen extracts and their Mechanisms to draw great attention on its potential clinical application on cancer therapy.

Keywords:Zangyinchen;Tibetan Medicine;Antitumor Activity;Amarogentin

藏茵陈,作为藏药八珍之一,始载于藏医药书 《晶珠本草》[1],与藏红花和冬虫夏草并称 “藏药三宝”。在传统藏医学中,藏茵陈主要指含龙胆科的獐牙菜属、龙胆属、扁蕾属、花锚属及腺鳞草属与虎耳草科虎耳草属植物等;我国獐牙菜属植物约有79种,其中可供藏茵陈使用的药用植物约有40余种,在基础研究和临床应用研究中使用范围较广的为扁蕾属湿生扁蕾(Gentianopsis paludosa Ma)、獐牙菜属川东獐牙菜(Swertia davidi Franch)、川西獐牙菜(Swertia mussotii Franch)、印度产獐牙菜(Swertia chirayita)、苇叶獐牙菜(Swertia phragmitiphylla)、印度獐牙菜(Swertia chirayita)、普兰獐牙菜(Swertia purpurascens Wall)、藏獐牙菜(Swertia racemosa)等药用植物[2]。藏茵陈因其活性物质獐牙菜苦苷、齐墩果酸与芒果苷等具有确切的肝胆疾病药理活性,常用于治疗各种热症、肝胆与血液疾病[3-5]。《中国药典》将其作为标准药材收录[6],《中国医学百科全书·藏医分卷》也汇集了以藏茵陈为主药命名的临床方剂共十余方[7]。

清热解毒的药物是中医最为关注的肿瘤预防与治疗的药物之一,现代药理研究表明,清热解毒药物可以通过直接抑制肿瘤细胞增殖诱导肿瘤细胞凋亡,或调节和增强机体的免疫能力,或诱导肿瘤细胞的分化与逆转以及抗突变等作用达到抗肿瘤作用[8]。藏茵陈及其提取物作为典型的清热解毒藏药,其抗恶性肿瘤活性的基础研究也陆续见诸报端。本文对国内外藏茵陈提取物抗肿瘤方面的药理研究情况进行整理总结,结合本课题组的研究工作,进一步展望藏茵陈抗肿瘤活性的研究方向与机制机理,以期推动藏茵陈及其提取物抗肿瘤的临床应用。

1抗肿瘤活性的研究进展

11抗肝癌活性藏茵陈富含獐牙菜苦苷、芒果苷、雏菊叶龙胆苷与熊果酸等活性成分,对于正常肝细胞损伤有显著的修复作用,因此研究藏茵陈提取物抗肿瘤活性的关注点大多首选在抗肝癌活性上,藏茵陈主要活性成分结构式见图1。

Lan D.等[9]研究了湿生扁蕾(Gpaludosa)中四种口山酮类化合物对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用,结果表明四种口山酮类化合物的半抑制率IC50为743~2829 μg/mL,且抑制HepG2细胞增殖呈剂量和时间依赖型。赵李剑等[10]发现川东獐牙菜(Sdavidi)的正丁醇提取物黄酮类化合物芒果苷和环烯醚萜类化合物獐牙菜苦苷能明显抑制HepG2细胞增殖,且对HepG2细胞的抑制具有协同作用。Mahendran [11]探讨了印度产Scorymbosa甲醇提取物对HepG2的细胞毒理,实验结果表明Scorymbosa甲醇提取物对HepG2具有明显的细胞毒性且IC50值为6164 μg/mL。纪兰菊等[12]发现了苇叶獐牙菜(Sphragmitiphylla)中新的抗肿瘤成分Swertiridoid A,实验表明该化合物对HepG2细胞有明显的抑制作用且IC50值为1893 μg/mL,为研制新的抗肝癌药物提供了新的先导化合物。周慧[13]通过体外实验观察Sdavidi黄酮类化合物去甲基雏菊叶龙胆酮和裂环烯醚萜苷类化合物苦龙苷对HepG2215 细胞的细胞毒性,研究结果表明去甲基雏菊叶龙胆酮的最大无毒浓度为150 μg/mL,对细胞产生 50%毒性的浓度为 300 μg/mL;苦龙苷的最大无毒浓度为 200 μg/mL,对细胞产生 50%毒性的浓度为 400 μg/mL。赵利剑等[14]对Sdavidi的正丁醇萃取物进行研究,其中含有獐牙菜苦苷以及其他苦苷类成分,实验结果表明苦苷浓度在35~50 μg /mL时,对肝癌细胞的抑制率可达到50%;其抑制作用可能是其它物质和獐牙菜苦苷协同产生且使獐牙菜苦苷的活性得到增强。黄华艺等[15]研究了黄酮类化合物芒果苷对人肝癌细胞株BEL-7404增殖的抑制作用,表明随着芒果苷浓度的升高和作用时间的延长,其对肝癌细胞株毒性作用增强且IC50为20 μmol/L,阻滞BEL-7404细胞周期于G2/M期。

通过国内专利检索,发现国内学者发明了含有藏茵陈的方剂用以治疗肝癌。孔倩倩[16]发明了一种治疗肝癌的药物组合;基于免疫組化法的结果表明此含有藏茵陈獐牙菜的药物组合能上调抑制基因P53的表达,下调凋亡抑制基因突变型P53的表达,能直接杀死H22肝癌细胞以抑制H22细胞增殖来诱导其凋亡。权栋栋等[17]的专利表明了一种九味獐牙菜片的制备方法及其对肝癌细胞Hepa1-6细胞的应用;基于MTT法的结果表明,与对照组相比,当九味獐牙菜片剂量达到5 mg/mL时对肝癌细胞Hepa1-6的抑制作用有差异;当剂量达到15~20 mg/mL时有极显著性的差异,表明九味獐牙菜片对Hepa1-6细胞的抑制作用成剂量依赖性。

部分文献还探讨了三萜类化合物熊果酸与齐墩果酸的抗肝癌活性,此类三萜类化合物在藏茵陈植物中也有较高的含量。Tian等[18]研究了熊果酸及其衍生物对肝癌细胞HepG2的作用,结果表明熊果酸能有效地抑制HepG2和其耐药株R-HepG2细胞的增殖,并对正常小鼠肝细胞没有毒性作用,进一步的研究机制表明熊果酸能阻滞HepG2细胞周期在G0~G1期,其作用机理可能是下调COX-2蛋白表达且上调了与凋亡相关的热休克蛋白HSP105 mRNA表达。董静等[19]通过齐墩果酸对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中细胞凋亡相关蛋白表达的影响研究中发现,荷瘤小鼠经齐墩果酸腹腔灌胃给药处理后,其肝/体比与脾脏指数较模型组的升高,凋亡抑制基因生存素及B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白的表达下调,且与模型组相比有显著性差异。

12抗结直肠癌活性根据《2012中国肿瘤登记年报》,结直肠癌位居我国癌症发病第3位与癌症死亡第5位,部分研究者进行了藏茵陈提取物抗结直肠癌活性的研究。张艳霞等[20]在Gpaludosa提取物对人结肠癌SW480细胞增殖和细胞周期的影响研究中发现,当提取物浓度达到40 mg/L时,对SW480细胞增殖抑制显著且具有明显的量效关系;当提取物浓度为30 μg/mL处理肿瘤细胞时,发现可诱导细胞周期停滞于G1期;进一步地,王雅莉等[21]采用RT-PCR法检测了Gpaludosa提取物对SW480细胞增殖调控因子 CyclinD、CDK4、PCNA和P21kip1 的mRNA表达的影响,实验结果表明SW480细胞经不同浓度提取物作用24h后,CyclinD、CDK4与PCNA mRNA表达随浓度的增加而减少,而P21kip1 mRNA的表达随浓度增加而增加,并呈现明显的剂量依赖关系。纪兰菊等[12]的专利中提及 Sphragmitiphylla中抗肿瘤活性成分Swertiridoid A对直肠癌细胞LoVo细胞有明显的抑制作用,其IC50值为1495 ~1700 μg/mL,是治疗抗直肠癌药物潜在的先导化合物。

13抗皮肤癌活性作为一种癌症预防和癌症治疗的新型药用资源,印度獐牙菜(Schirayita)富含三萜类、生物碱与环烯醚萜类等有效成分[22],Sata等[23]综述了Schirayita抗炎、抗氧化与抗肿瘤等的药理进展。此外,Sata等[24]研究了印度獐牙菜苦苷粗提物和纯化物的急性毒理以及对二甲基苯蒽诱导小鼠皮肤癌变模型的抑癌活性影响;实验结果表明,粗提物和獐牙菜苦苷剂量的急性毒理IC50分别为10 mg与05 mg;进一步的研究结果表明,粗提物与纯化物均能提升小鼠GST、GPx、SOD与CAT的分泌,且能有效地减轻二甲基苯蒽诱导小鼠皮肤乳头瘤的发生率,其主要机理在于獐牙菜苦苷能降低皮肤组织中癌细胞的增殖,与下调COX2表达、激活Caspase-3的表达有关。

14抗恶性血液疾病活性近年来,来源于间叶组织的恶性血液病的发病率也逐渐升高。Ding等[25]探讨了基于Gpaludosa中分离得到的1-羟基-3,7, 8-三甲氧基口山酮对人早幼粒白血病HL-60细胞增值影响,发现该口山酮能诱导HL-60细胞的DNA损伤,在较低浓度(124~744 μM)作用下将细胞周期停滞在G1期,在较高浓度(827~3308 μM)作用下将细胞周期停滞在G2/M期,从而抑制了HL-60细胞的增殖并呈时间和剂量依赖性。丁丁[26]通过研究芒果苷对人淋巴瘤Rsiji细胞的增殖与侵袭的影响中发现,芒果苷对Rsiji细胞的增殖抑制具有明显的剂量依赖性并呈现明显的时间依赖性;Western blot结果表明100 μmol/L 与200 μmol/L的芒果苷作用于Rsiji细胞24h后,同对照组相比,具有显著的抑制Rsiji细胞TIAM1蛋白的表达;进一步的Transwell 侵袭实验表明,用不同浓度的芒果苷作用于Rsiji细胞24h后可抑制Rsiji细胞穿透 Transwell 小室 Matrigel 模拟的天然基底膜,并随着浓度的增加呈剂量依赖性。

15抗其它癌症活性权栋栋等[27-31]的发明专利中基于MTT法探讨了九味獐牙菜片对乳腺肿瘤C127细胞、胃癌MFC细胞、淋巴瘤YAC-1、肺癌细胞LLC与畸胎瘤F9细胞的增殖抑制影响,结果表明对上述肿瘤细胞均有显著的抑制作用且成剂量依赖性。本课题组基于人胃癌细胞MGC-803对藏茵陈药用植物川西獐牙菜抗肿瘤活性以及活性成分进行研究,结果表明川西獐牙菜正丁醇部位增殖抑制最强并呈现明显的量效关系,且表现出明显的S期周期阻滞;HPLC-MS-MS分析结果表明正丁醇部位的主要活性成分多为口山酮类化合物,与文献报道相吻合[32]。

2抗肿瘤机制的研究进展

基于国内外关于藏茵陈提取物抗肿瘤活性的研究进展,进一步归纳总结了其抗肿瘤发生发展的机制,表明主要在以下三个方面。

21抑制肿瘤细胞的增殖及其机制国内外研究均表明,藏茵陈獐牙菜提取物中的獐牙菜苦苷、芒果苷、口山酮类在体内和体外对肝癌、皮肤癌、结肠癌等均具有不同程度的抗癌作用,其中口山酮类化合物可通过调节周期蛋白和周期蛋白激酶在周期调控中的活性,影响细胞周期分布,从而抑制癌细胞的增殖,并呈时间和浓度的依赖关系[21]。相关分子机制发现,藏茵陈Gpaludosa乙醇提取物通过抑制STAT3信号途径,降低了Bcl-xL的表达,从而抑制了癌细胞的增殖[33]。

22诱导肿瘤细胞凋亡癌细胞通常存在着凋亡异常的现象,进而呈现异常增殖的特性,诱导肿瘤细胞凋亡是抗癌药物及抗癌疗法的筛选标准之一。藏茵陈苷类化合物可通过调节Bcl-2和Caspase家族、促进ROS的产生[14]以及抑制NF-KB的活性直接诱导肿瘤细胞凋亡[34];经熊果酸处理后的HepG2细胞线粒体跨膜电位的损失,进而释放细胞质中的细胞色素Cytc,通过下调COX-2,上调P21的表达,从而诱导细胞凋亡[19];从分子机制方面阐述了獐牙菜苦苷能够选择性的下调COX-2的表达,上调Caspase-3的表达诱导细胞凋亡[35-36];齐墩果酸和熊果酸通过促使线粒体中细胞色素C释放到胞液,激活Caspase-9和Caspase-3,并诱导多聚ADP核糖多聚酶裂解,同时通过NF-KB活性和下调凋亡蛋白的XIAP诱导HuH7细胞凋亡[37]。

23抑制肿瘤侵袭和转移基于Transwell侵袭实验表明,藏茵陈芒果甙作用淋巴瘤细胞 Raji 24 小时后,可抑制 Raji 细胞穿透 Transwell 小室 Matrigel 模拟的天然基底膜,且具有明显的剂量依赖性,其机理在于可显著下调Raji细胞TIAM1mRNA的表达和TIAM1在蛋白水平的表达[27]。

3小结

作为藏药的八珍之一,藏茵陈类药用植物在我国分布区域较广,其獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、齐墩果酸、熊果酸与芒果苷等有效成分含量高且毒副作用小,具有很高的药用价值和经济价值。基于文献综述表明,国内外研究人员基于藏茵陈提取物进行的抗癌活性基础研究,主要呈现以下特点:①大多数研究基于体外的抗肿瘤细胞实验;②多数研究基于消化道肿瘤探讨藏茵陈提取物的抗癌活性,因其具有明确的肝胆疾病的药理作用,大多数文献基于抗肝癌活性进行研究;③国内已有一定的专利清晰地表明了藏茵陈及其提取物作为方剂在临床上的潜在应用。

体外细胞的药筛实验表明藏茵陈提取物具有明确的抗肿瘤活性且较小的量即可达到半抑制率,但是基于体内动物试验以及抗癌活性分子机制的研究仍较少,有待进行大量的深入研究;笔者所在课题组一直致力于基于藏茵陈提取物进行抗肿瘤活性物质的筛选。一方面,要深入研究高纯度藏茵陈提取物单体的工业提纯工艺;另一方面,藏茵陈提取物应按照抗肿瘤活性药物的筛选模式进行体内体外系统实验,为抗肿瘤临床应用提供坚实的依据。相信随着研究的不断深入,作为藏药八珍之一的藏茵陈在未来的肿瘤防治中将会有很好的应用前景。

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