“滋水涵木”针刺对局灶性脑缺血再灌注大鼠血管内皮生长因子、突触素表达的影响

夏文广，郑婵娟，张璇，王娟

“滋水涵木”针刺对局灶性脑缺血再灌注大鼠血管内皮生长因子、突触素表达的影响

夏文广，郑婵娟，张璇，王娟

目的：探讨“滋水涵木”针刺对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经血管单元相关蛋白血管内皮生长因子（VEGF）、突触素（SYN）表达的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠144只随机分为假手术组（n=30）、模型组（n=42）、针刺组（n=42）和针刺对照组（n=30）。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型（MCAO），针刺组和针刺对照组取太溪穴、太冲穴，针刺30 min，1次/日，6次/周，连续2周；假手术组、模型组术后不给予干预。术后第3、7、14天采用mNSS量表对大鼠进行神经行为学评分、TTC染色测脑梗死体积以及免疫组化SP法观察脑梗死周围皮质VEGF、SYN的表达。结果：针刺对照组和假手术组大鼠无神经功能缺损症状，TTC染色未见明显脑梗死灶，VEGF及SYN表达较弱；在术后第7、14天针刺组大鼠神经功能恢复明显优于模型组，术后第3天，针刺组与模型组比较脑梗死面积差异无统计学意义，在第7和14天针刺组脑梗死面积小于模型组（P＜0.05）；术后第3天，模型组VEGF明显高于假手术组和针刺对照组，在第7天达到高峰，第14天仍表达显著，针刺组在第7和14天VEGF的表达明显高于模型组（P＜0.05）；在各时间点模型组SYN表达均高于针刺对照组和假手组（P＜0.05），第14天表达最显著，针刺组则在第7和14天高于模型组（P＜0.05）。结论：“滋水涵木”针刺能促进大鼠脑梗死后神经血管单元的相关蛋白VEGF、SYN的表达，减少脑梗死体积，促进神经功能的恢复。

针刺；脑缺血再灌注；血管内皮生长因子；突触素

脑卒中具有高发病率、高致死率、高致残率和高复发率的特点，即使早期给予规范的药物和康复治疗，仍有50%～60%的患者遗留不同程度的功能障碍[1]。针对如何增加缺血性脑损伤局部的血液供应、挽救可逆性神经细胞、减轻神经细胞的毒性，减少神经细胞凋亡、使被抑制的神经细胞觉醒等，研究者提出了神经干细胞移植、炎症阻断剂、脑保护剂及凋亡抑制剂等新的治疗理念[2-4]，但以上方法均在实验阶段，是否会对人体造成潜在或长期的伤害还是未知的。针刺是传统医学的瑰宝，针刺治疗缺血性脑中风的临床报道也较多[5]，但其具体作用机制尚不完全清楚。本研究旨在观察针刺对局灶性缺血性脑损伤后神经血管保护机制，从神经血管单元（neurovascular unit，NVU）的角度为针刺治疗缺血性脑损伤提供理论依据和证据支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

1.1.1 主要试剂及设备 MCAO线栓购于北京沙东生物技术有限公司，水合氯醛购于北京化学试剂公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride, TTC）购于Sigma公司；突触素（Synaptophysin,SYN）兔抗多克隆抗体、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）小鼠抗单克隆抗体及SP试剂盒购于武汉博士德生物技术公司；石蜡组织切片摊片机购于武汉俊杰电子有限公司；倒置荧光显微镜购于OLYMPUS公司；成像系统购于Q-IMAGING公司。

1.1.2 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠144只，体质量（220±20）g，购自武汉大学动物实验中心。饲养环境：室温（22±1）℃，湿度55%～75%，12 h昼夜交替，自由饮水进食。SPSS19.0统计软件生成的随机数字表将大鼠随机分为假手术组30只、模型组42只、针刺组42只及针刺对照组30只。本实验得到湖北省中西医结合医院动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型的制作与筛选 参照Zea Longa法[6]制作MCAO及再灌模型。在室温21℃～25℃环境下进行，具体操作如下：10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射，大鼠麻醉后仰卧位固定于超净工作台手术板，钝性分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、迷走神经、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。微小动脉夹在CCA远端夹闭，近端剪V形小切口，将线栓沿CCA、ICA顺行向上插入至大脑前动脉（anterior cerebral artery，ACA），感微小阻力时即刻停止，从CCA分叉处计算线栓插入深度（1.7±0.2）cm，结扎颈总动脉CCA远端的丝线，造成大脑中动脉血供阻断。缺血2 h后，恢复大脑中动脉的血供。假手术组线栓导入深度1 cm后立即拔出。大鼠术后24 h，采用Zea Longa进行大鼠神经功能缺损情况评估，将评分为1～3分者纳入实验。

1.2.2 治疗方法 针刺组：造模成功的大鼠在24 h内进行“滋水涵木”针刺治疗，先固定大鼠头部及四肢，参照“动物针灸穴位图谱”（中国针灸学会实验针灸研究会制定）选取太溪穴、太冲穴进行针刺（苏州产“华佗牌”毫针，0.30 mm×25 mm），直剌0.2～0.5寸，进针深度约3 mm，留针30 min，1次/日，6次/周，连续2周。针刺对照组：不进行任何手术，针刺穴位、方法、频率和针刺组相同。假手术组和模型组：术后常规饲养于笼内，不进行任何干预治疗。

1.3 检测指标

1.3.1 改良神经功能缺损评分[7]（modified neurological severity scores,mNSS）评价行为学 分别于手术后第3、7、14天评估其神经功能缺损程度。mNSS包括运动功能（主要评估肌肉状态、异常运动）、感觉功能（主要评估视觉、触觉和本体感觉）和反射检查，综合评价大鼠神经功能损伤的严重程度。最终评分为4个项目的总和，其中18～13分表示严重损伤，12～7分表示中度损伤，6～1分表示轻度损伤。

1.3.2 TTC染色检测脑梗死体积 在设定的时间点每组大鼠随机取6只，断头处死大鼠，低温以前囟为基点连续冠状面切2 mm厚切片；37℃下2%TTC溶液中避光孵育30 min；于4℃、10%甲醛溶液中固定2 h。正常脑组织被染成均匀的红色而梗塞部分不着色，为白色。脑组织切片拍照，采用图像处理软件（USA）对切片进行分析处理。

1.3.3 免疫组化SP法检测大鼠脑梗塞区VEGF、SYN的表达 在第3、7、14针刺治疗结束完成mNSS评分后，每组随机取8只大鼠，10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，50 mL注射器针头插入左心室，同时剪开右心耳，经心脏快速灌注9%氯化钠溶液100～150 mL，再用4%的多聚甲醛溶液100～150 mL进行心脏灌注，两肺及肝脏逐渐变白，大鼠四肢剧烈抽动，颈部、四肢及尾巴僵硬，即灌注成功。立即断头取脑组织，参考《大鼠脑立体定向图谱》，冠状切取视交叉前2 mm～视交叉后2 mm组织块，4%多聚甲醛固定液浸泡24 h后脱水、浸蜡、石蜡包埋，切成4 μm石蜡切片。采用SP法参照试剂盒进行VEGF和SYN免疫组化染色，即将切片进行常规脱蜡及梯度酒精脱水，3%H2O2消除内源性过氧化物酶，微波抗原修复，分别一抗、二抗孵育，DAB染色，中性树脂封片，每只大鼠的相同部位进行连续5张的切片，200×显微镜下对SYN和VEGF的积分光密度值（integral optical density value，IOD）进行检测。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 神经行为学评分

术后3、7、14 d，针刺对照组和假手术组大鼠mNSS评分为0；术后第3天，模型组和针刺组大鼠神经功能缺损最严重，分别为（8.80±1.87）分和（8.30±1.42）分，但差异无统计意义（P＞0.05）；术后第7、14天，针刺组大鼠mNSS的评分分别为（6.10±1.35）分及（3.80±2.16）分，均低于模型组的（7.20±2.07）分和（5.40±2.24）分（P＜0.05或0.01），神经功能恢复明显优于模型组。

2.2 针刺对脑缺血再灌注后脑梗死面积的影响

术后3、7、14 d，针刺对照组和假手组未见明显脑梗死灶。术后第3天，针刺组与模型组比较脑梗死体积差异无统计学意义（P＞0.05）；在第7、14天，针刺组脑梗死体积小于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。针刺组与模型组脑梗死体积均在第7天达到高峰，第14天开始减少。见图1，图2。

图1 各组大鼠不同时间点脑梗死体积

图2 2组大鼠术后14 d时脑组织TTC染色

2.3 针刺对脑缺血再灌注大鼠梗死灶周围皮质VEGF表达的影响

假手术组和针刺对照组大鼠VEGF表达较弱。在脑梗死周边皮质区可见VEGF免疫阳性细胞，阳性细胞胞体成圆形或椭圆形，胞核较大，胞浆呈深棕黄色。各时间点，在大鼠脑梗死周边皮质部位，假手术组和针刺对照组比较无显著性差异（P＞0.05）；术后第3天，模型组VEGF的表达明显增加，高于假手术组和针刺对照组（P＜0.01），在第7天达到高峰，第14天仍表达显著；针刺组在第7和14天的VEGF的表达均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01或0.05），见图3，表1。

图3 各组大鼠不同时间点VEGF的表达（光学显微镜，×200）

表1 各组大鼠不同时间点的VEGF蛋白表达的IOD值（±s）

表1 各组大鼠不同时间点的VEGF蛋白表达的IOD值（±s）

注：与假手术组及针刺对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05；③P＜0.01

组别 只数脑缺血再灌注后时间针刺对照组假手术组模型组针刺组8 8 8 8 3 d 2188.32±770.42 2339.06±679.56 4177.18±516.35①4258.27±532.41①7 d 2201.53±810.61 2435.06±719.34 6158.27±646.59①7726.05±507.84①②14 d 2014.94±691.82 2135.81±704.51 5578.64±679.35①6495.47±662.96①③

图3 各组大鼠不同时间点SYN的表达（光学显微镜，×200）

2.4 针刺对脑缺血再灌注大鼠梗死灶周围皮质SYN表达的影响

镜下显示，针刺对照组和假手术组大鼠脑组织中仅见少量SYN阳性细胞表达；模型组和针刺组大鼠中，在缺血梗死中心区仅可见组织碎片，未见明显完整的细胞，而SYN几乎没有表达；在梗死灶的周边皮质区，可见SYN阳性细胞表达，呈棕黄色颗粒状，主要围绕在细胞周围，排列成环状、半弧形或者不规则团块，胞浆中表达较少。模型组SYN的表达明显高于假手术组和针刺对照组（P＜0.01），从第3天到第14天逐渐增加；针刺组在各时间点SYN的表达均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01或0.05），见图4，表2。

表2 各组大鼠不同时间点的SYN蛋白表达的IOD值（±s）

表2 各组大鼠不同时间点的SYN蛋白表达的IOD值（±s）

注：与假手术组及针刺对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05；③P＜0.01

组别 只数脑缺血再灌注后时间针刺对照组假手术组模型组针刺组8 8 8 8 3 d 22497.49±12658.35 23549.97±11239.41 34861.17±15562.32①40119.53±16698.59①②7 d 23187.17±13571.84 24191.83±12391.62 41758.34±16131.45①51894.73±15942.36①③14 d 24491.67±12482.51 24953.88±12279.67 49967.83±17836.16①60860.47±16649.24①③

3 讨论

中医治疗中风病历史悠久，缺血性中风以肝肾亏虚为本，风、火、痰、气、瘀为标，属本虚标实，虽病位在脑，但与肝肾密切相关；其病机之根本为肝肾阴亏，贯穿于中风病的整个病理过程。根据中医治病必求于本的治疗原则，当以“滋水涵木”为治疗中风病之大法。肝藏血、肾藏精，肝主筋、肾主骨，精血充足，则脑髓得养，神机得复，筋骨得养，肢体得复。原穴，是脏腑原气经过和留止于四肢部的腧穴。《灵枢·九针十二原》记载：“五脏有疾，应出十二原”，“五脏有疾，当取之十二原”。原穴可以反映脏腑盛衰、气血盈亏的变化，临床亦多取原穴来调整脏腑经络的虚实病变。太溪穴，为足少阴肾经的原穴、输穴，为肾之元气大会处，以补肾之本原，固其根本；太冲穴，属足厥阴肝经之输穴、原穴，为肝脏原气输注之处，具有疏肝解郁、平肝潜阳之功。研究发现针刺可改善大脑皮质运动功能区的血液循环；减少凋亡，促进中枢神经功能的恢复；改善脑部能量代谢；激活大脑皮质特定运动功能区域；改善患者的认知及日常生活能力，促进脑功能重塑等[8-10]。最近研究发现针刺通过对大脑边缘叶-旁边缘叶-新皮质环路起调控作用，可在脑内多级中枢产生广泛的脑功能调控效应，诱导大脑内在网络系统，产生对边缘叶系统脑功能活动的广泛抑制，进而达到全身多系统多器官的调制作用[11]。因此，本研究以“滋水涵木”法为理论基础，选择太溪穴施以捻转补法，太冲穴施以捻转泻法，从神经血管保护机制入手，探讨其作用机理。

NVU由神经元、血脑屏障[(blood brain barrier, BBB)，其中包括内皮细胞、基底膜、星形胶质细胞终足和周细胞]、小胶质细胞及细胞外基质（维持脑和神经组织完整性）共同组成的一个结构和功能的基本单元。NVU是一个概念性的框架，反应了脑组织各细胞间相互联系，相互影响及动态变化，将NVU作为一个整体来研究缺血性脑卒中的损伤和保护机制具有重要意义。国内近年来开展了部分针对缺血性脑损伤后血管神经网络调控的机制研究以及针刺、中药促进NVU重建的机理研究[12,13]，认为血管新生与神经元新生之间存在密切的联系[14]。SYN是一种Ca2+结合糖蛋白，位于突触囊泡膜上，为突触前传入神经纤维特异性标志物，是突触发生和突触重塑的重要蛋白标记物[15]。SYN的增加可反映神经传递的增加[16]，它的密度和分布可间接反映新生神经元的数量和分布[17]，对于神经可塑性及其研究具有重要意义。VEGF是一种内皮细胞特异的强效的有丝分裂原，与梗死灶周围新生血管的数量密切相关，作为刺激血管新生的核心代表，其表达增加可显著改善缺血半暗带的血供，促进侧枝循环的建立，为NVU提供了良好的微环境，对缺血损伤区的神经元和内皮细胞发挥直接保护作用[18,19]。因此，本研究以NVU相关核心蛋白VEGF和SYN作为检测指标，探讨针刺对缺血性脑损伤后的神经血管保护机制。

本研究发现在术后第7、14天针刺组大鼠神经功能恢复明显优于模型组，提示针刺治疗有助于缺血性脑损伤后运动功能的恢复；在第7和14天针刺组脑梗死体积均小于模型组，且针刺组VEGF、SYN的表达较模型组显著增加，表明脑缺血对VEGF和SYN的表达有诱导作用，而针刺能促进其在缺血损伤区的高表达，从而促进神经、血管的新生，通过NVU的网络重构，从多个方面，多角度发挥脑保护作用。本实验发现VEGF在第7天为表达高峰，后逐渐减弱，与脑梗死体积变化曲线一致，可能VEGF能通过恢复梗死区的血供，挽救缺血半暗带并促进神经功能的修复。Yang JP等[20]研究发现VEGF的调控是可变的，具有剂量依赖性，通过多种途径发挥作用，但其过表达反而对神经功能的恢复有害，作用的时间窗在短暂性脑缺血再灌注后3～24 h。SYN从缺血后第3天到第14天仍持续高表达，与VEGF的表达曲线不一致，可能与缺血性脑损伤后NVU的多因素复杂调节机制有关。

本实验结果提示“滋水涵木”针刺通过促进VEGF、SYN表达，促进NVU修复，从而改善缺血性脑损伤后大鼠神经功能。推测“滋水涵木”针刺主要作用机理是该干预方式能对神经元、微循环及神经胶质在内的NVU进行整体调节，弥补以往单一针对神经元或血管治疗的局限性，维持脑微环境的稳定，促进神经血管单元的再生和重构，实现大脑功能的重组，促进神经功能的恢复。但在本研究中未观察针刺对脑梗死区神经元细胞的凋亡及胶质细胞表达的影响，而缺血性脑损伤后神经元、脑胶质细胞和少突胶质细胞、微血管，3个方面组成了NVU，因此存在一定的局限性；同时本研究仅观察了针刺治疗14 d对血管新生的影响，尚需观察更长时间神经功能恢复及血管生成的情况，以上均是下一步研究的方向。

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（本文编辑：唐颖馨）

Effects of“Nourishing Liver and Kidney”Acupuncture Therapy on Expressions of Vascular En⁃dothelial Growth Factor and Synaptophysin after Cerebral Ischemia Reperfusion in Rats

XIA Wen-guang,ZHENG Chan-juan,ZHANG Xuan,WANG Juan.Department of Rehabilitation Medicine,Hubei Province Hospital of the Intergrated Chinese and Western Medicine,Wuhan 430015,China

Objective:To investigate the effects of acupuncture therapy on expressions of vasular endothelial growth factor（VEGF）and synaptophysin（SYN）after cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods:One hundred and forty-four healthy adult male SD rats were randomly divided into sham operation group(n=30),model group(n=42),acupuncture group(n=42)and acupuncture control group(n=30).The middle cerebral ischemia reperfusion model(MCAO)was established by suture method.Acupunctures were performed in the acupuncture group and acupuncture control group with at main acupoints of Taixi(K103),Taichong(ST09)of both sides,for 30 min.Then acupunctures were followed once daily in every morning,every 7-day for a course(acupuncture 6 days and rest 1 day).The sham operation group,model group were conventionally fed in the cages,without any intervention therapy.The rats of each group were assessed with Modified neurological severity(mNSS)scores, the infarct volume was calculated by TTC staining and the expressions of VEGF and SYN were detected with the method of immunohistochemical SP at the 3thd,the 7thd and 14th d.Results:Rats in acupuncture control group and sham operation group were presented no neurological deficit.The nerve functional recovery of rats in acupuncture group were significantly better than those in model group at the 7thd and 14thd after modeling.Acupuncture control group and sham operation group were presented no the infarct volume.The infarct volumes of acupuncture group were significantly smaller than those in model group at the 7thd and 14thd.At the each time point, the expressions of VEGF and SYN around the cerebral ischemia regions increased significantly in the model group,compared with the sham operation group and the acupuncture control group.In acupuncture group the expressions of VEGF at the 7thd,the 14thd increased more significantly than those in the model group.In acupuncture group the expressions of SYN at the each time point increased more significantly than those in the model group.Conclusion:The acupuncture therapy can promote the recovery of neurological function of focal cerebral ischemia reperfusion in rats which may be associated with increase of VEGF and SYN in the infarct regions.

acupuncture;cerebral ischemia reperfusion;vasular endothelial growth factor;synaptophysin

R741;R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.01.004

湖北省中西医结合医院康复医学科武汉 430015

人事部留学人员科技活动项目择优资助经费

2016-10-06

夏文广docxwg@163.com