淋巴管内皮细胞受体NRP2研究新进展

王静文，唐建武

·综 述·

淋巴管内皮细胞受体NRP2研究新进展

王静文，唐建武

NRP2是新近发现的淋巴管内皮细胞受体，其能与血管内皮细胞生长因子VEGFC/D结合，诱导肿瘤原有及新生淋巴管生成、分化和重构，促进肿瘤细胞向淋巴道迁徙、侵袭和转移。NRP2受体不仅是连接、启动、激活细胞外配体和细胞内信号通路的中枢结点，更是反映不同解剖学部位、不同组织学类型、不同发生发展阶段肿瘤特性的良好指标。了解NRP2受体结构功能的生化意义，确定其在VEGFC/D-NRP2反应轴中的核心地位，分析其与VEGFR3、NRP1等同类受体之间的相互关系，观察其在肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移时的表达规律，阐明其可能涉及的分子生物学机制，具有重要意义。

肿瘤；NRP2；淋巴管内皮细胞受体；淋巴管生成；淋巴道转移；文献综述

淋巴道转移是临床上最为常见的恶性肿瘤转移方式，约占转移性肿瘤来源途径的60%以上。有利于肿瘤淋巴道转移的主要因素有：(1)增强细胞外生长因子与淋巴管内皮细胞的特异性识别和专一性结合，促进肿瘤间质原有或新生淋巴管的结构重建和数量增加；(2)推动肿瘤细胞迁移穿越淋巴管内皮细胞屏障，进而侵袭进入淋巴道形成继发性肿瘤[1]。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)有A、B、C、D、E、F和胎盘生长因子(placenta growth factor, PLGF)等亚型，分别可与相应血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)1、2、3和神经纤毛蛋白(neuropilin, NRP)1、2等亚型结合。其中，配体VEGFA、VEGFB主要与位于血管内皮细胞的受体VEGFR1、VEGFR2、NRP1结合，配体VEGFC、VEGFD则更多与位于淋巴管内皮细胞的受体VEGFR3和NRP2结合。正是通过这种配体-受体间的相互识别和特异选择，才为其后定向调控血管生成和血道转移或淋巴管生成和淋巴道转移过程，奠定了不可或缺的分子生物学基础。

众所周知，VEGFR3是最早被发现和确定的VEGFC/D淋巴管内皮细胞受体，VEGFC/D-VEGFR3反应轴的激活，与淋巴管生成和肿瘤淋巴道转移过程密切相关[2]。近年研究发现，NRP2是VEGFC/D的又一淋巴管内皮细胞受体，VEGFC/D-NRP2反应轴的表达变化，也是影响这两个过程的重要分子生物学事件。因此，了解淋巴管内皮细胞受体NRP2的结构功能，确定其在VEGFC/D-NRP2反应轴中的角色地位，发现其与VEGFR3、NRP1等同类受体之间的相互关系，分析其在淋巴管增殖、分化、重构中的核心作用，揭示其在促进肿瘤细胞向淋巴道迁移、黏附、转移时的生化意义，总结其在不同解剖学部位、组织学类型和发生发展阶段肿瘤的变化规律，特别是阐明其发挥作用可能涉及的分子生物学机制，对于深入认识肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移的本质特征，具有至关重要的意义。

1 NRP2的结构功能

神经纤毛蛋白(NRP、NP、NPN)是多功能非酪氨酸激酶，1987年由Takagi等[3]通过免疫荧光法在非洲爪蟾蜍的神经组织冷冻切片中发现，其属于跨膜糖蛋白家族，相对分子质量为13.0×104～14.0×104。先前研究结果表明，NRP作为神经轴突导向因子(semaphorin)的受体，在神经系统细胞发生、发育中发挥引导调节作用。后来研究进一步确认，NRP也是VEGF受体家族成员，对脉管组织发生、发育具有协同促进作用。

NRP家族包括神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1, NRP1)和神经纤毛蛋白-2(neuropilin-2, NRP2)两个亚型，它们包含共有的基本结构，即860个氨基酸组成的胞外区、23个氨基酸组成的跨膜区以及约40个氨基酸组成的短胞内区。NRP胞外区拥有2个CUB结构域同源性区域(a1和a2)、2个凝固因子V/Ⅷ同源性区域(b1和b2)和1个含有MAM(meprin/A5/protein tyrosine phosphatase mu)结构域的c区域[4]。现已明确NRP中的a1a2结构域包含约220个氨基酸，主要与semaphorin相结合；b1b2结构域包含约150个氨基酸，与内皮细胞和血小板表面的膜磷脂相连，是结合VEGF所必需的结构域；c结构域则含有约170个氨基酸，介导蛋白与蛋白之间形成同源二聚体或者寡聚体，对于受体转导配体信号必不可少[5]。由于NRP蛋白上述区域位点具有选择性识别结合Semaphorin或VEGF的能力，导致NRP各亚型对神经组织或不同脉管细胞的发生、发育显示出不同的生物学效应[6]。

NRP2系1997年由Chen等[7]通过RT-PCR和转基因技术发现，又称为NP2、NPN2、PRO2714(protein2714)和VEGF165R2(vascular endothelial cell growth factor 165 receptor 2)等。NRP2基因长度约为110 kb，蛋白质含有931个氨基酸。NRP1与NRP2之间在结构功能上存在许多不同之处。NRP1主要表达于血管内皮细胞膜表面，与VEGF165(一种VEGFA剪接体)、VEGFB、VEGFE和PLGF2结合，对正常和肿瘤间质血管生成及血道转移意义重大。NRP2则主要表达于淋巴管内皮细胞膜表面，与VEGFC和VEGFD结合，调控正常和肿瘤间质淋巴管的生成发育和淋巴道转移过程[8]。NRP1基因定位在染色体10p12区域，NRP2基因则定位在染色体2q34区域。NRP1和NRP2基因的17个外显子中有12个外显子大小两者相异，这使得它们的蛋白质结构具有两个不同连接区域，一个位于b结构域与c结构域之间，另一个位于c结构域与跨膜结构域之间。NRP1多以不同的可溶蛋白形式存在，主要有s12NRP1、s11NRP1、sIIINRP1和sIVNRP1等四种异构体。NRP2则只有s9NRP2一种可溶形式，更多以不同的剪接体蛋白形式存在，主要有NRP2a和NRP2b两个亚型。NRP2a与NRP1有44%同源性，NRP2b与NRP1的同源性仅11%[9]。另外，NRP1中细胞黏附位点的氨基酸序列与NRP2中同样位点的氨基酸序列也不相同。

2 NRP2与VEGFR3的相互关系

VEGFR3和NRP2是目前公认的两个VEGFC/D特异性受体。一方面，NRP2可作为功能完整的独立受体，直接与VEGFC/D配体识别结合。如NRPb1b2结构域可不依赖肝素直接与VEGFC结合，在肝素存在时还增加配体-受体相互作用；NRPb1b2结构域与VEGFD的结合则需依赖肝素的存在。有实验研究结果发现，NRP2缺陷小鼠出生时即有小淋巴管和毛细淋巴管缺失，而集合淋巴管发育正常。进一步研究表明，胚胎早期静脉出芽形成原始淋巴管可能不需要NRP2参与，但其对胚胎后期淋巴管内皮出芽形成新生淋巴管却十分必要[10]。NRP2诱导的大肠癌淋巴管生成不依赖VEGF-C/VEGFR3通路，用VEGFC治疗或过表达VEGFR3，均不能消除NRP2表达降低所造成的淋巴管内皮细胞迁移和管腔形成能力的损伤[6]。另一方面，NRP2也可通过提高VEGFR3对VEGFC的反应敏感性来发挥共受体作用。Favier等注意到，由于NRP2胞内段较短，仅含44个氨基酸，本身可能不产生激酶信号，需通过与受体VEGFR3相互作用，才能共同促进淋巴管内皮细胞的增殖迁移以及淋巴管萌芽的形成延展。有研究发现，NRP2/VEGFR3双杂合小鼠淋巴管发育正常，无淋巴管出芽生长缺陷。Xu等[11]研究表明将敲除NRP2与敲除VEGFR3基因的小鼠交配，或将完全抑制NRP2基因表达的小鼠交配，均会出现淋巴管芽体发育障碍、淋巴管分支点减少和淋巴管扩张等。若将完全敲除NRP2和VEGFR3基因的小鼠与保留一半NRP2和VEGFR3基因的小鼠交配，可见更为严重的淋巴管形成减少、淋巴管生长紊乱和淋巴性水肿。抑制NRP2基因的表达，还会增加淋巴管出芽停止和回缩的几率。

3 VEGFC/D-NRP2反应轴的生物学效应

VEGFC/D-NRP2生物化学反应轴，由位于细胞外的VEGFC/D为配体、位于细胞膜的NRP2为受体、位于细胞质的该轴通路相关分子为执行者等部分组成。其中配体VEGFC/D是轴首，受体NRP2是轴心，轴通路相关分子是轴尾。NRP2不仅是识别、诱导、趋化细胞外环境配体的关键因素，也是连接、传递、转导细胞内外网络信号的中枢结点，还是启动、整合、放大细胞内轴通路相关分子活性的始动开关，更是VEGFC/D-NRP2轴选择性定位于淋巴管内皮细胞的决定因素。只有当NRP2的轴心作用得到充分体现时，VEGFC/D-NRP2反应轴才能有效调控肿瘤原有及新生淋巴管生成、分化和重构，最终推动肿瘤细胞向淋巴道迁徙、侵袭和转移。淋巴管内皮细胞内外信号传递转导效率的高低，配体VEGFC/D与该轴通路相关分子协同整合的优劣，均受制于NRP2亲和力、饱和度、有效性等因素的影响[12]。

已有研究发现，NRP2能刺激淋巴管向外发出萌芽，调节淋巴管生长前缘顶端内皮细胞的延展，而这种出芽延展方式恰是新生淋巴管网建立的细胞学前提[11]。NRP2高表达不仅导致淋巴管内皮细胞迁移、出芽、延展，也吸引VEGFC/D向原有和新生淋巴管内皮细胞趋化。利用NRP2特异性抗体，能有效阻滞淋巴管生长前缘顶端内皮细胞的出芽延展。NRP2也可以通过调整细胞骨架极性，促进淋巴管内皮细胞迁移和淋巴管腔形成[13]。当VEGFC表达相对增多或VEGFD表达相对减少时，即VEGFC/D两者比值升高时，VEGFC/D配体可获得更多机会与NRP2受体结合，这无疑是导致肿瘤间质淋巴管生成活跃的重要原因之一[14-15]。

4 NRP2在不同肿瘤及其淋巴道转移时的表达改变

近年越来越多证据显示，在各种不同解剖学部位、不同组织学类型和不同发展阶段的肿瘤，特别是在这些肿瘤的淋巴管形成重构和淋巴道侵袭转移过程中，NRP2受体表达改变十分常见，并且与肿瘤组织起源、增殖状态、形态类型、恶性程度、转移方式、临床分期等临床病理特征密切相关。

已有研究表明在淋巴管内皮细胞，选择性抑制VEGFC和NRP2表达或者阻断NRP2与VEGFC结合，均会显著减少肿瘤淋巴管新生及淋巴道转移[16]。Caunt等发现阻断NRP2功能，能降低肿瘤淋巴管形成和淋巴管密度，肿瘤转移至前哨淋巴结和远隔器官均明显减少。NRP2基因敲除小鼠的小淋巴管和新生毛细淋巴管缺乏，肿瘤淋巴道转移受到抑制。NRP2表达降低可减少肿瘤组织淋巴管密度，改善肿瘤患者预后。降低NRP2表达可以提高肿瘤细胞凋亡数量，减少大肠癌原发灶体积和淋巴道转移率[6]。Nasarre等[17]研究显示非小细胞肺癌NRP2表达高于癌旁组织，NRP2高表达者较低表达者的肿瘤分级、分期及预后更差。最新对乳腺癌和神经胶质瘤的研究认为，NRP2参与VEGFC诱导的淋巴管内皮细胞迁移和肿瘤新生淋巴管的功能。NRP2在正常乳腺组织中少有表达，在乳腺癌组织淋巴管及淋巴结转移中表达明显增高。NRP2在神经母细胞瘤早期和进展期的表达，较正常组织明显上调。结直肠癌中NRP2高表达者的淋巴结转移率显著高于低表达者，并与肿瘤分化程度、Duke分期密切相关[18]。唾液腺样囊性癌组织NRP2高表达，与间质微脉管密度、肿瘤大小、临床分期和转移显著相关。NRP2在正常患者血清中不表达，而在食管鳞癌患者血清中表达显著增高。

不少作者发现NRP2也在肿瘤细胞中明显表达。免疫组化染色结果显示，NRP2可定位于结肠癌细胞质，且与VEGFC表达呈正相关[6]。NRP2在食管鳞癌细胞中和转移淋巴结中的表达均明显高于相应正常组织。Fung等[19]对食管鳞癌体外研究结果显示，NRP2具有促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及内皮细胞管腔形成的能力。Yasuoka等[20]研究表明NRP2在正常甲状腺组织淋巴管中不表达，但在甲状腺乳头状癌组织中的淋巴管及肿瘤细胞中均有表达。NRP2在膀胱癌、内分泌腺肿瘤和黑色素瘤细胞中高表达，与肿瘤分期、分级程度相关，并可以作为上述肿瘤诊断的重要标志物[21-22]。通过shRNA技术抑制NRP2在胰腺癌细胞中表达，可降低肿瘤细胞侵袭和转移程度，而NRP2高表达则促进胰腺癌细胞生长、迁移和侵袭。MTT和流式细胞检测显示，联合抑制NRP2和VEGFR3表达对胃癌细胞增殖的抑制率，比分别抑制单一受体的增殖抑制率高，对胃癌细胞凋亡的诱导作用也更显著。王璐璐等[23]研究显示RNAi干扰NRP2基因表达后，人胃腺癌细胞SGC7901的裸鼠体内侵袭能力明显降低，且减少了癌细胞增殖和微淋巴管密度。RNAi干扰下调结肠癌LoVo细胞株NRP2表达，可以显著降低裸鼠结肠原位移植瘤的淋巴管生成密度，抑制结肠癌细胞的增殖，肿瘤转移至前哨淋巴结和远隔器官也均明显减少。VEGFC/NRP2反应轴通过激活自噬过程，使前列腺癌细胞逃避化疗所致的细胞死亡，而这一作用为VEGFC/NRP2轴所特有[24]。

NRP2是通过调节VEGFC/D-NRP2轴通路相关分子功能，来发挥促进肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移作用的。淋巴管内皮细胞中NRP2的激活，可上调整合素α9β1表达或促使其聚集，进而激活NRP2下游重要分子FAK/Src和Rac1/MAK/ERK/Akt等，以及更下游的MAPK激酶(MEK)[6]。高表达的NRP2也可通过增加淋巴管内皮细胞整合素α9β1表达水平，诱导VEGFR3磷酸化，继而激活下游趋化因子CXC受体4(CXCR4)[25-26]。当NRP2低表达时，足突膜蛋白(podoplanin)表达也降低。在荷瘤小鼠胃癌组织淋巴管中，NRP2表达与淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)表达呈正相关。果蝇同源异形盒蛋白1(prox1)在淋巴管内皮细胞表型分化过程中，具有上调NRP2和抑制NRP1表达的作用。VEGFC/D与NRP2结合后也可以通过整合素α6β1，进一步激活FAK调解细胞骨架结构和细胞黏附，同时通过调节主要干细胞因子表达诱导肿瘤去分化[27-28]。此外，NRP2在结肠癌细胞中的表达，可以促进信号转导蛋白Smad2/Smad3复合物磷酸化，推动TGFβ1/Smads信号通路介导的上皮-间质转化，从而增强肿瘤细胞侵袭转移的能力。

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时间：2017-2-27 10:14

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国家自然科学基金(81071725)、辽宁省财政厅高等教育专项资金(20121203)

大连医科大学病理学教研室/辽宁省肿瘤转移及干预重点实验室，大连 116044

王静文，女，博士研究生，助教。Tel: (0411)86110298， E-mail: 30388487@qq.com 唐建武，男，博士，教授，博士生导师，通讯作者。Tel: (0411)86118866，E-mail: jianwutang@163.com

R 730

A

1001-7399(2017)02-0186-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.016

接受日期：2016-10-25