肌萎缩侧索硬化患者血浆转化生长因子-α水平的变化及其意义

阎俊，李作汉，章文斌，徐运

肌萎缩侧索硬化(ALS)是致死性的神经系统变性疾病，死于该病的患者估计全球每年约有3万人，该疾病病程短、进展很快，平均生存期约为24～48个月[1]。迄今为止，选择性运动神经元受累变性的发病机制还尚不明了，炎症机制是其中的可能因素之一[2]。自从1995年抑制谷氨酸兴奋性毒性作用的力如太被美国食品药品管理局批准用于治疗该疾病以来，有超过60类药物分子被用于尝试治疗ALS，但大多数的药物实验并未取得预期疗效[1]。探寻该疾病的病理机制，寻找针对机制的有效治疗药物，延长患者的病程迫在眉睫。CNS损伤后，继发的神经炎症反应中激活的小胶质细胞扮演着重要的角色。转化生长因子-α(TGF-α)与主要表达于星形胶质细胞和小胶质细胞中的表皮生长因子受体(EGFR)结合，激活EGFR信号通路，从而使受体C端酪氨酸残基自身磷酸化发挥生物学效应。该信号通路激活有可能起到促炎加重神经元损伤的作用。目前尚未有ALS患者血浆TGF-α水平研究的报道，本研究尝试通过探讨该细胞因子在ALS患者及其不同亚组间血浆水平的变化，探讨其在疾病中可能起到的病理作用，为酪氨酸激酶抑制剂等治疗ALS的措施提供更多的理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象 (1)患者组：系2010年7月～2014年11月南京脑科医院门诊及住院的48例ALS患者，男26例，女22例，男女比例1.18∶1，年龄37～74岁，平均(54.52±10.20)岁。入组标准：诊断符合国际Escorial 修订版诊断标准,“临床确诊”及“临床拟诊”的患者[3]。排除标准：入组前2个月服用解热镇痛消炎药、甾体激素及他汀类药物；已行经皮胃造瘘术；预测用力肺活量<50%；糖尿病患者；有系统性感染的患者。(2)正常对照组：系年龄、性别与患者组匹配的同期57名正常体检者，男31名，女26名，男女比例1.19∶1，年龄36～72岁，平均(55.67±9.07)岁。该研究获得南京医科大学附属脑科医院伦理委员批准，伦理号(2010)伦审第(06)号。

1.2 方法

1.2.1 资料收集与分亚组 患者诊断后均进行功能评分(ALSFRS-R评分)[4]，根据评分结果评估疾病的严重程度，将患者分为ALSFRSR评分≤24分(重度临床状态)和>24分(轻度临床状态)两个亚组[5]。根据起病部位，将患者被分为延髓起病和肢体起病两个亚组；患者的平均病程19.3个月(2～96个月)，根据病程，将患者分为病程≤12个月和>12个月两个亚组[5]；根据性别，将患者分为男女两个亚组。

1.2.2 血浆TGF-α水平的检测 提取血浆：48例ALS患者于诊断后、57名正常对照者于体检后分别抽取肘静脉血1 ml，采用EDTA抗凝。在2～8 ℃下离心机(上海天美科学仪器有限公司CT15RT)1000 r/min离心15 min，离心后取上清，置于EB管。标本采集后30 min内放入冰箱(中国海尔公司)，-80 ℃冷冻保存备用。检测标本：标本送到Merck Millipore公司上海总部实验室，用MILLIPLEX MAP 液相芯片试剂盒(产品编号HCYTOMAG-60K)完成血浆TGF-α水平检测。

2 结 果

2.1 各亚组基本资料 将患者根据性别、年龄、病程、起病部位、功能评分分为若干亚组。病程≤12个月患者26例，平均年龄(55.00±8.89)岁，男14例，女12例;病程>12个月的患者22例，平均年龄(53.95±11.75)岁，男12例，女10例。延髓起病的患者12例，平均年龄(59.33±12.54)岁，男7例，女5例;肢体起病的患者36例，平均年龄(52.92±8.92)岁，男19例，女17例。ALSFRS-R评分>24分的患者37例，平均年龄(53.78±9.52)岁，男20例，女17例;ALSFRS-R评分≤24分的患者11例，平均年龄(57.67±12.04)岁，男性6例，女性6例。

2.2 各组血浆TGF-α水平的比较 ALS组患者血浆TGF-α水平(8.42±7.19)pg/ml，较正常对照组(2.12±0.59)pg/ml明显升高(P<0.05)。男性患者与女性患者血浆TGF-α水平分别为(8.67±7.53)pg/ml与(8.12±6.93)pg/ml，均较正常对照组明显升高(均P<0.05)，但男性患者和女性患者间差异无统计学(P>0.05)。年龄≤55岁的患者和年龄>55岁的患者血浆TGF-α水平分别为(8.26±7.01)pg/ml与(8.56±7.49)pg/ml，均较正常对照组明显升高(均P<0.05)，但年龄≤55岁的患者与年龄>55岁的患者间差异无统计学(P>0.05)。病程≤12个月患者与病程>12个月患者的血浆TGF-α水平分别为(6.13±5.85)pg/ml，(11.12±7.79)pg/ml，均较正常对照组明显升高(均P<0.05)。而且，病程>12个月患者的血浆TGF-α水平较病程≤12个月的患者明显升高(P<0.05) 。延髓起病的患者、肢体起病的患者血浆TGF-α水平分别为(8.12±8.24)pg/ml与(8.52±6.93)pg/ml，均较正常对照组明显升高(均P<0.05)，但延髓起病的患者和肢体起病的患者间差异无统计学(P>0.05)。ALSFRS-R评分≤24分的患者与ALSFRS-R 评分>24分的患者血浆TGF-α水平分别为(12.90±9.67)pg/ml与(7.08±5.79)pg/ml，均较正常对照组明显升高(均P<0.05)，但ALSFRS-R评分>24分的患者和ALSFRS-R 评分≤24分的患者间差异无统计学意义(P>0.05) 。进一步统计学分析揭示，患者的血浆TGF-α水平与病程统计呈正相关(RRho=0.314，P=0.030) 。

3 讨 论

ALS是一种迄今为止发病机制仍不明的疾病，只有大约5%～10%的ALS病例是家族性的，其余病例是散发性的，可能是多种基因变异和复杂环境因素共同作用所致[6-7]。该疾病病理生理机制复杂，炎症机制可能是其中若干因素之一。研究[8]认为，在该疾病的早期,小胶质细胞处于M2表型，起到抑炎作用，后期随着病程发展，转化为M1表型，释放促炎因子加速疾病的进展。

作为表皮生长因子(EGF)家族的一员，TGF-α是EGFR内源性配体之一，通过与表达于星形胶质细胞和小胶质细胞中的EGF受体结合，使受体C端的酪氨酸残基自身磷酸化，从而起到促进细胞生长、转化的作用。自身磷酸化的EGFR促进小胶质细胞和星形胶质细胞由静息态向激活态转变，激活态细胞释放大量自由氧，导致脂质过氧化、谷氨酸兴奋性毒性反应，同时可以释放大量炎性因子，产生过量的一氧化氮，最终导致神经元死亡[9]。有证据[10]表明，EGFR信号通路在ALS病理生理机制中发挥重要作用。

作为抑制谷氨酸兴奋性毒性作用的力如太是1995美国食品药品管理局(FDA)最早批准用于口服治疗ALS的药物[1]。2016年，在SOD1G93A型ALS突变鼠动物模型的研究中发现，模型鼠出现肢体瘫痪7 d后给予口服高选择性酪氨酸激酶抑制剂马赛替尼(Mastinib)30 mg/(kg·d)，最终与对照组比较，能够延长模型鼠瘫痪后生存期40%。研究[11]发现，高选择性酪氨酸激酶抑制剂马赛替尼能抑制异常小胶质细胞的增殖，阻滞小胶质细胞迁移和神经炎症，欧洲药物管理局孤儿药品委员会于2016年8月授予马赛替尼治疗ALS的孤儿药地位。

本研究发现，患者血浆中激活EGFR信号通路的EGF TGF-α水平明显高于正常对照组，对患者亚组分析发现，各患者亚组与正常对照相比有明显统计学差异(均P<0.05)，病程>12个月的比病程≤12个月的血浆TGF-α水平明显升高(P<0.05)，且指标与病程呈正相关，可以推断血浆TGF-α在ALS的炎症机制中起到一定作用，可能随着病程的增加，血浆TGF-α水平增加，可能使星形胶质细胞和小胶质细胞中EGF受体C端的酪氨酸残基自身磷酸化作用加强，增强EGFR信号通路的激活，促进疾病进展。不同的起病部位、性别、年龄之间差异无统计学意义，说明该指标与起病部位、性别、年龄无相关性。而且，该指标与疾病严重程度之间差异无统计学意义，可能与受试者数量相对较少有关，今后应增加更多的入组病例数。

目前尚未有ALS患者血浆TGF-α水平研究的相关报道，本研究可以推断血浆TGF-α在ALS炎症机制中起到一定的作用，并可能起到加速病情进展的作用，该指标可能成为推断疾病进展的生物标记。本研究可以尝试为酪氨酸激酶抑制剂治疗ALS提供更多的理论依据。目前，以EGFR作为药物靶点的创新药物研究，多集中在肿瘤领域[12]，近年针对ALS病理机制的药物研究层出不穷，本研究可以为今后应用EGFR抑制剂作为ALS治疗的药物靶点迈出尝试的一步。ALS作为一种罕见病，发病率相对较低，该疾病标本的留取存在一定困难，进一步研究需要更大的群组研究和更多的患者亚组，开展纵向研究，今后将对实验方案设计作进一步完善。

[1] Petrov D, Mansfield C, Moussy A, et al. ALS clinical trials review: 20 years of failure. Are we any closer to registering a new treatment?[J]. Front Aging Neurosci, 2017, 9: 68.

[2] Ehrhart J, Smith AJ, Kuzmin-Nichols N, et al. Humoral factors in ALS patients during disease progression[J]. J Neuroinflammation, 2015, 12: 127.

[3] Li DW, Liu M, Cui B, et al. The awaji criteria increases the diagnostic sensitivity of the revised El Escorial criteria for amyotrophic lateral sclerosis diagnosis in a Chinese population[J]. PLoS One, 2017, 12: e0171522.

[4] Maier A, Holm T, Wicks P, et al. Online assessment of ALS functional rating scale compares well to in-clinic evaluation: a prospective trial[J]. Amyotroph Lateral Scler, 2012, 13: 210.

[6] Mitchell J, Borasio G. Amyotrophic lateral sclerosis[J]. Lancet, 2007, 369: 2031.

[7] 孟祥鹏，陈立杰，孙宝红．肌萎缩性侧索硬化发病的分子生物学机制及治疗进展[J]．临床神经病学杂志，2012，25：395.

[8] Geloso MC, Corvino V, Marchese E, et al. The dual role of microglia in ALS: mechanisms and therapeutic approaches[J]. Front Aging Neurosci, 2017, 9: 242.

[9] Nitta M, Kozono D, Kennedy R, et al. Targeting EGFR induced oxidative stress by PARP1 inhibition in glioblastoma therapy[J]. PLoS One, 2010, 5: e10767.

[10] Morello G,Spampinato AG,Conforti FL,et al.Selection and prioritization of candidate drug targets for amyotrophic lateral sclerosis through a Meta-Analysis approach[J].J Mol Neurosci,2017, 61: 563.

[11] Trias E, Ibarburu S, Barreto-Núez R, et al. Post-paralysis tyrosine kinase inhibition with masitinib abrogates neuroinflammation and slows disease progression in inherited amyotrophic lateral sclerosis[J]. J Neuroinflammation, 2016, 13: 177.

[12] Li W, Zhou F, Zhou C. Role of erlotinib in the targeted treatment of non-small-cell lung cancer in Chinese patients[J]. Onco Targets Ther, 2014, 7: 253.