深圳地区103例非小细胞肺癌患者EGFR基因突变分析*

王礼法 刘爱胜 余树林 施俊柱 程文德 刘小君

·临床检验·

深圳地区103例非小细胞肺癌患者EGFR基因突变分析*

王礼法 刘爱胜 余树林 施俊柱 程文德 刘小君

目的 了解深圳地区非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变情况，为NSCLC患者药物靶向治疗提供科学依据。方法 收集2013年3月~2015年11月深圳地区3家三级区属医院的103例NSCLC肺癌组织，分别提取DNA，采用突变特异性扩增系统（ARMS）扩增检测EGFR基因外显子18、19、20及2l的突变情况，并统计分析EGFR基因突变率。结果 103例NSCLC患者中EGFR基因总突变率为38.8%（40/103），其中第18、19、20及21外显子突变分别占总突变的2.5%（1/40）、35.0%（14/40）、5.0%（2/40）及57.5%（23/40）；腺癌患者EGFR基因突变率为48.7%（37/76），高于非腺癌患者的11.1%（3/27），差异有统计学意义（χ2=25.617，P<0.01）；不吸烟的NSCLC患者EGFR基因突变率为56.1%（32/57），明显高于吸烟患者的17.4%（8/46），差异有统计意义（χ2=20.195，P<0.01）；女性患者突变率为52.4%（22/42），高于男性患者的29.5%（18/61），差异有统计意义（χ2=5.127，P<0.05）；≤56岁的NSCLC患者EGFR基因突变率为39.5%（17/43），>56岁的患者为38.3%（23/60），差异无统计学意义（χ2=0.618，P>0.05）。结论 深圳地区NSCLC患者EGFR基因突变主要以21外显子为主，其次为19外显子；腺癌、女性及不吸烟NSCLC患者EGFR基因突变率较高，可接受EGFR-TKIs治疗。

非小细胞肺癌 表皮生长因子受体 基因突变

NSCLC患者EGFR基因突变主要存在于第18~21外显子上[1]。不同种族、同一种族不同地域EGFR的突变种类和突变频率都存在很大差异。已有研究表明，中国不同地区人群EGFR基因突变状态存在差异，如云南地区EGFR基因突变主要集中在l9外显子，21外显子突变罕见，而上海地区19和21外显子的突变发生率基本相同[2]。但目前为止，未见深圳地区大样本EGFR基因突变的分析报道。为此，本研究对深圳地区103例NSCLC患者EGFR基因突变情况进行调查，探讨EGFR突变与患者性别、吸烟史、组织学类型等临床特征的关系，以期为深圳地区NSCLC患者的药物靶向治疗提供参考依据。

对象与方法

1 对象 收集2013年3月~2015年11月深圳地区3家三级区属医院呼吸和危重症医学科诊治的NSCLC患者103例，其中男性61例，女性42例；年龄37～82岁，平均年龄56±17.6岁；≤56岁43例，>56岁60例；有吸烟史46例，其中男性40例，女性6例；无吸烟史57例，其中男性21例，女性36例。

2 方法

2.1 NSCLC病理类型：收集超声支气管镜（EBUS）、支气管镜、内科胸腔镜活检和经CT、B超引导下穿刺活检原发灶或转移灶组织标本。所有肿瘤组织标本切片后，均经HE染色，由2名病理科医生确诊为NSCLC。采用 WHO肺癌分类及诊断标准[3]，并由2位病理医生确诊，其中腺癌（ 腺癌和腺鳞癌）76例、非腺癌（ 鳞癌26例、大细胞癌1例）27例。所有NSCLC患者术前未接受过放化疗和EGFR-TKI等抗肿瘤治疗。

2.2 标本采集：活检标本采用中性福尔马林溶液固定石蜡包埋，经病理科医生评估并选取肿瘤细胞>50%的石蜡组织，切取8 μm厚的石蜡切片5~10片，置于无菌EP试管内。

2.3 DNA提取：每一标本从石蜡包埋的肿瘤组织中切取8 μm厚切片，取5~10片置于1.5 ml Eppendorf管，加适量二甲苯脱蜡，然后加入适量乙醇洗脱二甲苯，室温或37℃晾干，直到乙醇完全蒸干；加入180 μl Buffer ATL，再加入2 μl蛋白酶K，震荡混匀；56℃消化过夜，直至样品完全裂解；90℃孵化1 h，等温度降到室温，快速离心收集管壁上的液体；加入200 μlBuffer AL混匀，再加入200 μl无水乙醇充分混匀震荡后，快速离心收集管壁上的液体；将上清液小心转移到QIAamp吸附柱中，8 000 r/min离心1 min，将QIAamp吸附柱置于新的2 ml收集管；小心打开盖子，加入500 μlBuffer AW1，8 000 r/min离心1 min，倒掉废液，加入500 μl Buffer AW2，8 000 r/min离心1 min，倒掉废液，将QIAamp吸附柱放置于干净的2 ml收集管，14 000 r/min空管离心3 min；将QIAamp 吸附柱置于新的1.5 ml离心管中，将100 μl Buffer ATE加至QIAamp吸附柱中心，盖上盖子，室温孵育5 min后，14 000 r/min离心1 min，收集产物置–20℃冰箱保存。

2.4 提取DNA量的检测：DNA收集产物稀释200倍后应用美国赛默飞公司Thermo Scientific Nano Drop2000 超微量分光光度计，分别检测260 nm和280 nm处OD值，DNA含量为：260 nm OD值×10（μg/μl）。

2.5 提取DNA质的检测：DNA产物260 nm OD值/280 nm OD值应在1.8~2.0。

2.6 实时荧光定量PCR扩增：采用扩增耐受突变系统（ARMS）[4]扩增EGFR基因18、19、20及21外显子。具体操作方法按人类EGFR基因突变检测试剂盒（苏州为真生物医药科技有限公司）说明进行。每次实验均设定各突变阴、阳性对照孔及空白对照孔，反应循环参数：95℃ 5 min；95℃20 s，57℃ 32 s，循环5次；95℃ 20 s，60℃ 35 s，循环40次。

3 统计学处理 应用SPSS19.0软件进行统计分析，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验，以 P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 NSCLC患者EGFR基因突变情况 103例NSCLC

患者肺癌组织标本中EGFR基因总突变率为38.8%（40/103），其中18、19、20及21外显子突变分别占总突变的2.5%（1/40）、35.0%（14/40）、5.0%（2/40）及57.5%（23/40）。

2 不同病理类型 NSCLC患者EGFR基因突变情况 腺癌（包括腺癌和腺鳞癌）的突变率48.7%（37/76）高于非腺癌（包括鳞癌和大细胞癌）的11.1%（3/27），其中女性腺癌患者的EGFR基因突变率为64.5%（20/31），明显高于男性腺癌患者的37.8%（17/45）；女性鳞癌患者EGFR基因突变率为22.2%（2/9），明显高于男性鳞癌患者的5.9%（1/17），差异均有统计学意义（χ2=11.964~25.617，P<0.05~0.01）。

3 吸烟与不吸烟NSCLC患者EGFR基因突变率 不吸烟NSCLC患者EGFR基因突变率为56.1%（32/57），明显高于吸烟者的17.4%（8/46），其中男性不吸烟NSCLC患者为61.9%（13/21），高于吸烟患者的12.5%（5/40）；女性不吸烟患者为58.3%（21/36），高于吸烟患者的16.7%（1/6），差异均有统计学意义（χ2=9.162~27.601，P<0.05~0.01）。

4 不同性别NSCLC患者EGFR基因突变率 女性EGFR基因突变的发生率52.4%（22/42），显著高于男性的29.5%（18/61），突变率的差异有统计学意义（χ2=5.127，P<0.05）。

5 不同年龄段NSCLC患者EGFR基因突变率≤56岁的NSCLC患者EGFR基因突变率为39.5%（17/43），>56岁的患者为38.3%（23/60），差异无统计学意义（χ2=0.618，P>0.05）。

讨 论

肺癌是全球发病和致死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要类型，约占85% ~90%，每年可导致超过100人死亡[5，6]。肺癌确诊时大多已属中晚期，传统的化疗药物疗效有限。目前，针对肿瘤细胞内的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的小分子酪氨酸酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）类靶向药物，如吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）已被广泛应

用于NSCLC治疗[7]，并显示出良好的治疗效果，在肺癌的个体化治疗中具有里程碑式的意义[8]。研究显示TKIs治疗晚期NSCLC的疗效受到EGFR基因突变状态的影响，只有EGFR基因为突变型的患者才能从该类靶向药物的治疗中获益[9]。因此，EGFR基因突变状态可作为能否采用 EGFR酪氨酸酶抑制剂的重要依据。

根据国内有关文献报道，中国不同种族及同一种族不同地区的NSCLC患者EGFR突变存在明显差异。本研究结果显示，深圳地区NSCLC患者EGFR基因总突变率为38.8%，高于赵瑾等[10]报道湖南地区的35.3%和卢天龙等[11]报道青海地区31.3%，低于郑军等[12]报道湖南地区45.8%和刘安等[13]报道蚌埠地区的43.8%，明显高于王剑蓉等报道江苏地区的28.37%[14]，而与林群英等[15]报道莆田地区的37.7%和唐艳萍等[16]报道广西地区的40.1%相一致，进一步证实我国不同地区NSCLC患者EGFR基因突变存在差异，原因目前尚不明了，需进一步深入研究，可能与不同地区人群的遗传背景、生活环境和发病机制的差异等因素有关。

肿瘤的EGFR突变体最主要出现在EGFR酪氨酸激酶编码区，集中在18~21外显子，占突变类型的90%以上，多为框内缺失性突变或替代突变[17，18]。不同地区NSCLC患者EGFR基因突变的类型存在很大差异，如北京和上海地区EGFR基因第l9和21外显子突变占总突变率的比例相近，约45%；广东地区EGFR突变以第l9外显子为主，突变占59.1%，21外显子突变占27.3%；云南地区19外显子突变占36.2%，外显子21突变罕见，仅为1.72%；台湾地区EGFR突变以第21外显子为主，占总突变的76%。本研究结果显示，深圳地区NSCLC患者EGFR基因突变主要以21外显子为主，其次为19外显子，突变率分别为57.5%和35.0%，说明深圳地区NSCLC患者对TKIs药物治疗有一定的敏感性，但18和20外显子也出现了2.5%和5.0%的EGFR基因突变率，说明深圳地区已有极小部分NSCLC患者对吉非替尼和厄罗替尼产生了抗性。因此，深圳地区NSCLC患者使用TKIs药物治疗前进行EGFR基因突变情况检测非常必要。

本研究结果显示，腺癌患者EGFR基因突变率为48.7%，高于非腺癌的11.1%；不同年龄段NSCLC患者EGFR基因突变率的差异无统计学意义（P>0.05），但女性EGFR基因突变率为52.4%，明显高于男性的29.5%，不吸烟者56.1%明显高于吸烟者的17.4%，不同性别吸烟NSCLC患者EGFR基因突变率也存在一定的差异性。因此，NSCLC患者在应用TKIs靶向药物治疗前进行EGFR基因突变状态检测，对指导及获得更佳的治疗具有重要的临床意义。

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10 赵瑾，田俏梅，黄玉梅，等.湖南地区238例非小细胞肺癌EGFR基因突变状态分析[J].肿瘤药学，2014，4（3）：187-191.

11 卢天龙，杨启英. 150例青海地区非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体突变状态分析[J].检验医学与临床，2016，13（1）：31-32.

12 郑军，谢贵元，李姣，等.非小细胞肺癌EGFR基因突变的临床意义研究[J].中国肿瘤临床，2014，41（14）：904-907.

13 刘安，陈余清，孙哲，等.非小细胞肺癌EGFR基因突变与临床特征分析[J].浙江临床医学，2015，17（10）：1660-1662.

14 王剑蓉，陈劫，孙怡，等.肺癌表皮生长因子受体基因测序分析[J].海南医学，2014，25（10）：1405-1408.

15 林群英，朱林剑.莆田地区非小细胞肺癌患者EGFR基因突变分析[J].莆田学院学报，2014，21（2）：27-29.

16 唐艳萍，张力图，谭晓玉，等.广西南宁地区非小细胞肺癌EGFR基因突变分析[J].现代肿瘤医学，2014，22（5）：1067-1070.

17 Kosaka T，Yatabe Y，Encoh H，et a1.Mutations of the epicermal growth factor receptor gene in lung cancer：biological and clinical implications[J]. Cancer Res，

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18 周瑞芳，卢仁泉. EGFR基因突变检测的临床应用[J].现代检验医学杂志，2013，28（3）：72-74.

Analysis of EGFR Gene Mutation in 103 Patients with Non-small Cell Lung Cancer in Shenzhen

WANG Li-fa，LIU Ai-sheng，YU Shu-lin，et al.
Micro Inspection Department of Shenzhen Luohu District，the Center of Disease Control and Prevention，Guangdong 518020

Objective To understand non-small cell lung cancer（NSCLC）epidermal growth factor receptor（EGFR） mutations in Shenzhen，and to provide a basis for target therapy of NSCLC patients. Methods collected from March 2013 to November 2015 in shenzhen area three level 3 district hospital，One hundred and three cases of NSCLC cancer tissues were collected in 3 hospitals from 2013 to 2015，and DNA was extracted followed by detections of EGFR gene mutation in exon 18，19，20 and 2l using mutations specific amplification system （ARMS） amplification. Results All of 103 cases of NSCLC showed an EGFR gene mutation rate of 38.8% （40/103），among them 18，19，20 and 21 exon mutations rates were 2.5%（1/40），35.0%（14/40），5.0%（2/40），and 57.5%（23/40），respectively. EGFR mutation rate was 48.7% （37/76）in patients with adenocarcinoma，higher than 11.1%（3/27）in the patients with nonadenocarcinoma.（χ2=25.617，P<0.01）. EGFR mutation rate in NSCLC patients of nonsmookers was 56.1% （32/57），significantly higher than the smooker patients（ 17.4%，8/46） （χ2=20.195，P<0.01）. The mutation rate in female patients was 52.4%（22/42），higher than that of the male （29.5%，18/61）（χ2=5.127，P<0.05）. The patients below 56 years exhibited an EGFR mutation rate of 39.5% （17/43），compared to those over 56 years （38.3%，23/60）（χ2=0.618，P>0.618）.Conclusion EGFR mutations in NSCLC patients are mainly composed of exon 21，followed by exon19. Adenocarcinoma，femal，and nonsmoker patients seem to be the risk factors of EGFR gene mutation.

Non-small cell lung cancer Epidermal growth factor receptor Gene mutations

R734.2 R34

A

1671-2587（2017）03-0248-03

2016-11-11）

（本文编辑：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.012

*本课题受广东省深圳市龙华新区科技创新项目（No.2015-0924A103085）资助

518020 广东省深圳市罗湖区疾病预防控制中心微检科（王礼法）；深圳市龙华新区人民医院（刘爱胜，余树林）；深圳市龙华新区中心医院（施俊柱，程文德）；深圳市光明新区人民医院检验科（刘小君）

王礼法（1982–），男，主管技师，学士，主要从事分子生物学及微生物工作，（E-mail）wanglifa321@163.com。