真菌检验技术进展

余进

(北京大学第一医院，北京大学真菌和真菌病研究中心，北京市皮肤病分子诊断重点实验室，北京 100034)

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真菌检验技术进展

余进

(北京大学第一医院，北京大学真菌和真菌病研究中心，北京市皮肤病分子诊断重点实验室，北京 100034)

真菌检验技术主要包括传统的真菌涂片镜检和真菌培养、组织病理学检查、血清学检查、分子生物学技术和质谱技术。近年来，在临床需求的促进下，真菌检验技术的开展受到重视。传统技术进一步优化和改良，新技术日益推广应用，分子生物学技术和质谱相关技术持续研发，变革带来的成果有目共睹。该文对近年来重要的真菌检验新技术(真菌涂片荧光染色技术、血清学检验技术中抗体检测、抗原检测和真菌细胞壁葡聚糖检测)的应用以及分子生物学技术和质谱相关技术的研究进展进行综述。

真菌感染；检验技术；进展

近年来，真菌感染日益受到人们重视。深部真菌感染病例逐渐增多，临床医生对真菌检验的需求和依赖也越来越高。这些来自于临床的需求进一步促进了传统真菌检验技术的提高并且推进了新技术的应用。真菌检验技术主要包括传统的真菌直接涂片镜检、真菌培养、真菌鉴定、组织病理学检查以及新型的血清学检测、分子生物学技术和质谱技术。真菌涂片镜检和真菌培养是真菌检验的基础，目前仍有重要价值，不能忽视。真菌检验新技术推广迅速，但也存在一些无法回避的问题，需要充分认识。本文介绍了涂片镜检、形态鉴定、血清学方法、PCR技术以及质谱技术在真菌学检测中的应用及进展。

1 真菌涂片镜检技术

真菌涂片镜检技术操作简单，结果直观，能够快速报告，是真菌检验的基本技术。真菌涂片一般采用1.78 mol/L KOH溶液制片，KOH能够溶解人体细胞，但对真菌无染色强化作用，需要操作者根据经验判读结果，有时会出现假阴性或者假阳性情况。KOH溶液可以用于甲屑、毛发等标本的检测。某些体液标本，比如痰液较黏稠时也可使用KOH溶液作为载浮液进行涂片观察。乳酸酚棉蓝染料可将真菌成分染成蓝色，一般用于对培养后菌种进行观察，也可以和1.78 mol/L KOH溶液混合后用于真菌直接涂片检查。墨汁染色主要用于脑脊液标本的隐球菌筛查。对直接涂片标本进行革兰染色可以发现放线菌，诺卡菌等细菌以及念珠菌、隐球菌等酵母菌。丝状真菌一般为革兰阴性。荧光染色技术使用特殊的荧光染料，可以特异性结合真菌细胞壁的几丁质和葡聚糖，在荧光显微镜下荧光标记的真菌易于观察，形态清晰，提高了真菌镜检的敏感性[1]，适用于目前发现的各种致病真菌的直接涂片检查。基于镜下真菌形态特征，还可以进一步对致病真菌种类进行提示性诊断，更具临床价值。本实验室在应用过程中发现，真菌涂片荧光染色适用于多种标本，除了常规的痰、尿、便、皮屑、甲屑、各种体液标本以外，对于组织标本也可以直接压片染色，同样可以观察到真菌成分。

2 血清学检验技术

血清学检验技术包括抗体检测、抗原检测和真菌细胞壁葡聚糖检测。

2.1抗体检测 一般应用于免疫正常人体或免疫基本正常人群，而明显免疫抑制患者可能由于抗体滴度过低检测不到。目前抗体检测主要用于组织胞浆菌病、球孢子菌病、变应性支气管肺曲霉病和慢性坏死性肺曲霉病中，而对易于出现侵袭性肺曲霉病、念珠菌病和隐球菌病的免疫功能明显受损人群则应用意义不如抗原检测。组织胞浆菌抗体检测方法有免疫扩散试验(immunodiffusion,ID)和补体结合试验(conplement fixation,CF)2种方法：ID试验针对组织胞浆菌M抗原(一种过氧化氢酶)和H抗原(β-葡萄糖苷酶)，一般2个抗体都阳性时有诊断意义[2]；CF方法比ID方法更敏感，但交叉反应较多见。球孢子菌抗体检测的方法包括ID、CF和酶联免疫分析法(EIA)：ID试验检测IgM类抗体(针对β-葡萄糖苷酶抗原)，在感染早期出现；CF试验检测IgG类抗体(针对几丁质酶抗原)，可以用于急性、慢性感染的诊断以及预后判断；EIA方法具有更高的灵敏度，可以作为疾病筛查方法，用于疾病诊断时需要其他方法辅助[3]。变应性支气管肺曲霉病患者可检测曲霉特异的IgE类抗体。慢性肺曲霉病主要继发于既往肺部疾病患者，例如肺结核出现肺部空洞的患者，这类患者曲霉特异性IgG类抗体出现升高，检测曲霉特异性IgG可用于辅助诊断[4]。

2.2抗原或者真菌细胞壁成分检测 包括曲霉半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)抗原、隐球菌抗原、念珠菌抗原和细胞壁1，3-β-D-葡聚糖检测。这些检测主要针对免疫受损人群出现的条件致病真菌感染，对于高危患者的早期诊断和治疗监测有重要价值，但在应用中也存在一些局限性。

GM是曲霉细胞壁的组成成分，可溶于液体，在培养过滤液、血液、支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolus lavage fluid, BALF)等体液中均可检测到。GM具有抗原性的成分是β(1-5)呋喃半乳糖残基。目前检测试剂盒是通过EB-A2单克隆抗体与GM抗原结合，采用双抗体夹心ELISA方法。GM抗原检测可以早期辅助诊断侵袭性曲霉病，这一指标已经作为重要的微生物学证据列入EORTC/MSG2008年修订的侵袭性曲霉病诊断标准中[5]。血清GM检测(GM试验)在不同人群中应用价值也存在差异：骨髓移植患者、血液系统恶性病这类侵袭性肺曲霉病高发人群应用价值较高，而在实体器官移植患者和 ICU患者中敏感度下降[6]。GM抗原检测不仅可以用于患者血清，也可以检测BLAF。在血液系统恶性病、造血干细胞移植患者中，BALF中GM值的升高能够提高侵袭性肺曲霉病诊断的灵敏度。对于非血液病患者，BALF也能显著提高诊断的效率。我中心曾比较BALF和血清GM试验在非血液病人群的诊断价值，研究显示BALF更为敏感，敏感性达85.4%，同时血清GM试验的敏感性为67.9%[7]。尽管提高了灵敏度，BALF更容易出现假阳性。BALF GM的诊断界值至今没有统一的标准，但不可否认其仍具有重要价值。

隐球菌荚膜多糖抗原检测主要有3种方法，乳胶凝集法(LA)、EIA和胶体金免疫沉淀法(LFA)。三者对隐球菌病诊断价值均较高。其中LFA是2009年Immuno-Mycologics(IMMY)公司推出的诊断试剂， 操作更为简便，反应时间缩短到10 min，结果更客观，可进行定性和半定量检测。将EIA和LFA进行比较发现，二者一致性为 97%，LFA更敏感，对于隐球菌病诊断的敏感性和特异性分别为100%和99.6%[8]。隐球菌病最常见于中枢神经系统，即隐球菌性脑膜炎。在2008年EROCT/MSG侵袭性真菌病诊断标准中，脑脊液荚膜多糖抗原阳性可以作为隐球菌性脑膜炎确诊证据。在肺隐球菌病中，血清荚膜多糖抗原阳性同样具有很高的敏感性和特异性[9]，假阴性出现于抗原滴度低于检测限、感染菌株缺乏荚膜等情况，有时抗原浓度过高也可以出现假阴性，称为“前带效应”，需要稀释后再次检测。荚膜多糖抗原检测除了可以用于脑脊液和血清的检测外，也可以用于尿标本[10]。

念珠菌抗原检测主要针对3种抗原成分：(1)念珠菌细胞壁上的甘露聚糖和甘露聚糖蛋白；(2)念珠菌烯醇化酶；(3)念珠菌特异的一组热敏感循环抗原。其中甘露聚糖抗原应用较多。甘露聚糖蛋白是念珠菌细胞壁外层的主要可溶性抗原成分，血液中一过性存在，免疫正常宿主很快清除，免疫抑制者清除减慢。甘露聚糖抗原检测特异性较好，但敏感性相对较低，在特殊人群中例如粒细胞缺乏或者ICU患者中敏感性提高。针对甘露聚糖，相应抗体检测试剂盒的诊断敏感性提高，但特异性较差，在念珠菌定植时容易出现假阳性。目前推荐联合应用甘露聚糖抗原和抗体检测。一般甘露聚糖抗原阳性出现早，甘露聚糖抗体阳性出现晚，二者不同时升高。对于粒细胞减少者，甘露聚糖抗原和抗体的诊断界值均下调，对于血液病房和ICU患者，更易出现甘露聚糖抗原阳性，对于外科病房患者甘露聚糖抗体阳性更常见[11]。

1,3-β-D-葡聚糖是真菌细胞壁的重要组成成分之一，多种真菌(接合菌和隐球菌除外)的细胞壁都具有这一成分，而其他微生物、动物及人的细胞不含该成分。1,3-β-D-葡聚糖可以释放入血，逐渐被清除，免疫受损人群清除较慢，可以作为侵袭性真菌感染的早期诊断标志。1,3-β-D-葡聚糖检测可以用来诊断念珠菌、曲霉、镰刀菌、毛孢子菌、枝顶孢、暗色真菌、肺孢子菌等感染，但是不能区分感染真菌的种类，检测中会遇到假阳性和假阴性问题。近年来，我国出现若干针对葡聚糖检测的国产试剂，在应用中存在一些不足，比如缺少大样本、不同高危因素人群应用方面的研究。整体研究试验中确诊病例少，总敏感性60%～70%，特异性70%～90%，阴性预测值较高，除外的意义更大；高危人群(血液病化疗后、移植患者)阳性预测值较高，对于一般住院患者则较低[12]。

3 分子生物学技术

将分子生物学技术用于致病真菌的核酸检测一直是研究热点。分子生物学从出现至今，技术方面已经发展成熟。其用于感染诊断的优势显著，无论是在检测速度、检测敏感性、特异性，还是鉴定种属、耐药基因检测方面都是传统真菌镜检、培养和血清学方法难以达到的。

用于分子诊断的标本包括血液、BALF以及组织等。实验室研究中多采用实时PCR(real-time PCR)或者巢式PCR方法，针对临床相对常见的念珠菌、曲霉和毛霉等开发特异性引物或者探针。我实验室曾对94名怀疑侵袭性肺曲霉病(IPA)患者同时收集BALF和血清进行实时PCR和GM检测，BALF检测中，实时PCR检测特异性优于GM试验；血清检测中，GM试验和实时PCR二者敏感性和特异性相当[13]。

随着实验室研究的进展，商品化分子检测方法也逐渐出现，包括PCR-测序 (PCR-sequencing, 如MicroSeq, Applied Biosystems)[14]。PCR-微芯片(PCR-microarray, 如Luminex xMAP technology)[15]、PCR-核磁共振分析(PCR-magnetic resonance assay, T2Dx, T2 Biosystems)[16]、PCR-电喷雾电离质谱法(PCR-electrospray ionization mass spectrometry, Abbott IRIDICA，Abbott Molecular )[17]。但是，这些方法也存在问题，例如Micro-Seq和PCR-microarray均只能检测无菌样本，容易污染。核磁分析可以检测血液标本，但是仪器昂贵，检测真菌种类有限。电喷雾电离质谱法可以检测BALF，但仪器价格昂贵。到目前为止，真正推广应用的商品化真菌分子检测方法凤毛麟角，主要与样本中真菌核酸载量低、样本污染、DNA提取和分子检测标准化问题以及临床意义有关。

4 质谱技术

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)可以检测生物大分子，在微生物鉴定领域有广泛的应用前景。MALDI-TOF MS可以快速鉴定细菌、酵母菌和丝状真菌，方法相对简便，耗时短，结果的准确性高，越来越受到检验工作者的青睐。在真菌鉴定中，酵母菌鉴定比较成熟，可以达到90%以上的准确性[18]。丝状真菌鉴定不断发展，逐渐规范了培养和蛋白质提取方法，数据库也日益完善，鉴定的准确性也越来越高。MALDI-TOF MS除用于真菌鉴定外，还可以对某些样本进行直接检测，例如血培养阳性的标本或者尿液。主要涉及细菌鉴定，其中血培养念珠菌阳性的标本也可以检测[19]。直接检测受到菌量、是否单一致病菌以及其他细胞成分的影响，仍需深入研究。

MALDI-TOF MS技术还可以用于细菌毒力、耐药性和耐药机制研究，这些应用多集中于细菌，但是随着技术的成熟必然会推广到真菌。目前，已经出现采用MALDI-TOF MS对真菌药物敏感性进行检测。其应用依赖于在不同药物浓度下真菌表达的蛋白质谱差异。Marinach等[20]研究氟康唑对念珠菌的敏感性，采用念珠菌出现质谱图改变的最小药物浓度(MPCC)作为指标。而另一项研究念珠菌和曲霉对棘白菌素类药物敏感性的研究中采用拟合相关指数(composite correlation index，CCI)作为指标[21]。MALDI-TOF MS用于药敏检测的优势在于可以快速发现耐药菌株，但是涉及药物种类有限，仍处于实验室研究阶段。

5 真菌的形态学检查

致病真菌可以分为两类，(类)酵母菌和丝状真菌，其中丝状真菌的形态多样，具有明显的种属特征。对丝状真菌形态特征的掌握可以帮助快速鉴定菌种。形态鉴定包括菌落的大体形态和显微镜下表现。真菌在不同培养基、不同培养温度下的表现存在差异，所以观察形态时要采用标准或常用的真菌培养基，一般为马铃薯琼脂或沙氏琼脂，培养温度为28 ℃左右。很多致病丝状真菌实验室培养时仅能观察到其无性生殖状态，根据其无性孢子的发生方式进行描述鉴定。产孢方式一般分为芽生和丝裂2种，芽生中包括瓶梗、环痕、合轴和同步产孢；丝裂中包括全丝裂、全分节和内分节，对应产生相应的粉孢子和节孢子。很多真菌还可以在菌丝中间或末端产生厚壁孢子。这些特征都有助于鉴定菌种。我们在学习形态学特征鉴定的同时，一定要认识到致病真菌种类繁多，新发致病菌种层出不穷，形态表现也千变万化，仅仅依靠形态学来鉴定菌种存在很大的局限性。随着我们对真菌认识的日益加深，复合群越来越多，这些复合群中的菌种没有形态差异或者差异很小，所以分子鉴定更加准确可靠。分子鉴定结合形态学检查是真菌鉴定的发展趋势。

6 结语

真菌检验属于微生物检验的一部分，在病原学诊断中占有重要地位，早期快速、准确可靠的真菌感染诊断对临床帮助巨大。理想的检验方法应更敏感、准确，并且操作简便，未来真菌检验必然向着这一方向发展。技术的进步为实现这一目标提供了可能。未来我们将更加依赖分子技术，无论是DNA还是蛋白质，都有可能成为新的分子标记。二代测序技术的不断完善也将大大提高检测的敏感性。从历史的角度来看，没有任何一种技术是万能的，我们寄希望于新技术带来革命性改变的同时，仍要关注传统技术的改良，荧光染色涂片就是一个范例。未来人工智能的发展也许能够解决形态学检查的困境。

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2017-03-02)

(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.01

余进，1974年生，女，主任医师，博士，从事真菌和真菌病研究。

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