八肽胆囊收缩素对缺氧缺血性细胞损伤模型的干预作用

刘瑛，周江堡

(攀枝花市妇幼保健院儿科，四川 攀枝花617000)

八肽胆囊收缩素对缺氧缺血性细胞损伤模型的干预作用

刘瑛，周江堡

(攀枝花市妇幼保健院儿科，四川 攀枝花617000)

目的 研究八肽胆囊收缩素(CCK-8)对缺氧缺血神经细胞凋亡的干预作用，以及凋亡过程中对神经生长因子(NGF)蛋白及NGF mRNA表达的影响。方法 体外培养新生大鼠大脑皮层神经细胞7d，作为空白对照组(A组)，用50μmol/L谷氨酸浸泡处理后建立缺氧缺血细胞损伤模型(B组/模型组)，将CCK-8分别以浓度1×10-6mol/L (C组)、1×10-7mol/L(D组)、1×10-8mol/L(E组)进行干预，作用后继续培养细胞24 h，采用原位末端标记技术检测各组细胞凋亡率、免疫细胞化学检测NGF蛋白表达，原位杂交技术检测NGF mRNA表达。结果A组细胞有少量凋亡，凋亡率为(8.49±4.54)%，C组和D组细胞凋亡率分别为(3.87±5.64)%、(7.84±4.19)%，较B组的(17.53±6.93)%明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而E组凋亡率为(13.27±3.41)%，与B组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；A组未检测出NGF蛋白表达(OD值0)，C组[OD值(0.343 2±0.006 81)]和D组[OD值(0.301 2±0.001 87)]较B组[OD值(0.2 83 7±0.007 69)]NGF蛋白表达明显增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，E组[OD值(0.275 2±0.003 73)]与B组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；A组有少量NGF mRNA表达[OD值(0.286 6±0.004 41)]，C组[OD值(0.347 4±0.010 04)]和D组[OD值(0.329 4±0.019 22)]较B组[OD值0.301 2±0.001 87)]NGF mRNA表达明显增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，E组[OD值(0.296 8±0.003 78)]与B组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论CCK-8能够抑制缺氧缺血细胞模型凋亡，减轻神经细胞损伤的程度，其神经保护机制与促进NGF蛋白及NGF mRNA表达增加有关。

胆囊收缩素；细胞凋亡；干预

近年来，有许多国内外研究表明，胆囊收缩素(CCK)是一种内源性神经保护因子，具有神经保护作用[1]。CCK的神经保护机制目前尚不明确，学者们对此说法不一，其研究多数还在起步阶段，目前无统一定论。本实验通过外源性CCK-8干预体外培养的缺氧缺血性神经细胞损伤模型，探究对神经元凋亡和神经生长因子(NGF)表达的影响，探讨CCK的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 本实验所用新生SD大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，主要试剂有：CCK-8(美国Sigma公司)、谷氨酸(上海生物工程有限公司)、DMEM/F12培养基(德国Biochrom公司)、NGF免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，NGF原位杂交试剂盒及TUNEL试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)。

1.2 原代培养神经细胞 取新生＜24 h的SD大鼠大脑皮层组织，剪碎后放入DMEM/F12培养液中，胰酶反应、过滤、离心后，取细胞组织加入含15%胎牛血清的培养液，然后充分吹打均匀成细胞悬液，在培养板中接种培养(密度：1×105细胞/mL)，再置入37℃、5%CO2培养箱，孵育48 h后更换新鲜培养液，继续培养，培养第3天，10 μmol/L的阿糖胞苷加入培养液予以抑制非神经细胞增殖，以后每3 d更换1次培养液。

1.3 实验分组 将细胞随机分空白对照组(A组)、谷氨酸处理组(B组/模型组)、1×10-6mol/L的CCK-8处理组(C组)、1×10-7mol/L的CCK-8处理组(D组)和1×10-8mol/L的CCK-8处理组(E组)，每组6孔。

1.4 建立缺血缺氧损伤细胞模型 细胞培养7 d后将培养液吸出，细胞爬片用50 μmol/L谷氨酸+ D-Hanks液浸泡处理，30 min后用DMEM洗两遍，再用1/2DMEM/F12(含15%胎牛血清)加入1/2原培养液继续培养细胞24 h。空白对照组的细胞爬片则用D-Hanks液(未加谷氨酸)浸泡处理30 min，其余步骤相同。

1.5 施加CCK-8药物处理 实验C、D、E组加入CCK-8，在加谷氨酸前1 h加入，分组加入1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L的不同浓度CCK-8的培养液，处理1 h后吸出细胞培养液，细胞爬片用DMEM/ F12洗两遍，再用谷氨酸+D-Hanks液浸泡处理，30 min后取出细胞爬片，用D-Hanks液洗细胞2遍后，再加入含不同浓度CCK-8的原培养液，继续培养细胞24 h。空白对照组和谷氨酸处理组不予CCK-8处理，仅以D-Hanks洗2遍，其余步骤相同。

1.6 检测指标及方法 各组细胞生长至第9天时用于检测。

1.6.1 神经细胞形态学观察 各组细胞爬片均用0.01%吖啶橙染色，封片处理后在荧光显微镜下观察。

1.6.2 检测NGF蛋白表达和NGF mRNA表达 采用免疫细胞化学技术检测NGF蛋白表达，NGF mRNA表达则采用原位杂交技术，所有步骤均参照试剂盒说明书进行。

1.6.3 检测神经细胞凋亡 采用原位末端标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡，所有步骤均参照试剂盒说明书进行。阳性细胞：蓝紫色颗粒状物着色于胞核内(凋亡细胞)。阴性细胞：细胞核、胞浆不着色。随机取10个高倍镜视野计凋亡细胞数目，并计算各组细胞的凋亡百分率。

1.7 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察结果 在荧光显微镜下，A组呈现的细胞形态基本正常，胞质和胞核可见均匀的荧光染色，神经细胞之间的网状连接较为完整，B、E组见部分细胞变形，细胞核及核染色质固定、缩小，可见细胞内的凋亡小体；C、D组见大部分细胞形态维持较好，核、质无明显改变，凋亡细胞较少，见图1。

2.2 细胞凋亡率检测结果TUNEL检测各组细胞凋亡率的结果见表1。数据表明，C组、D组有抑制凋亡的作用，且与浓度呈正相关，浓度越高，作用越强，而E组则没有作用。

2.3 NGF蛋白和mRNA表达检测结果NGF蛋白和mRNA表达检测结果显示见表1。数据显示，C组、D组NGF蛋白表达和NGF mRNA表达明显增高，与浓度呈正相关，浓度越高，表达越强。而E组与B组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 荧光显微镜下细胞形态学观察

表1 各组细胞NGF蛋白及mRNA表达及细胞凋亡率比较(±s)

表1 各组细胞NGF蛋白及mRNA表达及细胞凋亡率比较(±s)

注：与B组比较，aP＜0.05。

组别NGF蛋白(OD值)NGF mRNA(OD值)细胞凋亡率(% A组B组C组D组E组F值P值0 0.283 7±0.007 69 0.343 2±0.006 81a0.301 2±0.001 87a0.275 2±0.003 73 1 150.14＜0.05 0.286 6±0.004 41 0.301 2±0.001 87 0.347 4±0.010 04a0.329 4±0.019 22a0.296 8±0.003 78 58.64＜0.05 8.49±4.54 17.53±6.93 3.87±5.64a7.84±4.19a13.24±3.41 6.45＜0.05

3 讨论

CCK是广泛存在于人体的胃肠道和中枢神经系统的一种脑肠肽。CCK的最小活性片段为CCK-8，是CCK在神经系统的主要存在形式。综合近年来多项研究结果，归纳CCK-8的神经保护作用主要为：减轻缺氧性神经细胞损伤[2]，抑制癫痫发作[3]，延缓神经细胞老化[4]，提高认知、空间、学习、记忆功能[5]，减轻局部脑缺血再灌注损伤[6]等等。

有研究发现，缺氧缺血性脑损伤引起谷氨酸过度蓄积，与不同类型受体作用，造成神经元兴奋性损伤甚至死亡[7]。本实验采用谷氨酸处理的细胞模型来模拟缺氧缺血性细胞损伤，予CCK-8干预后，细胞形态接近正常神经细胞，细胞凋亡率明显下降，这证明CCK-8能够抑制皮层神经元凋亡，减轻神经细胞的损伤程度，增强神经细胞的保护修复功能，有拮抗谷氨酸的神经兴奋性毒性作用。同时，实验给予外源性CCK-8干预后，NGF蛋白和mRNA表达明显增加，且对CCK-8有浓度依赖性，这提示CCK-8可能通过刺激NGF表达增加而达到神经保护的作用。

目前，国内外学者对CCK的神经保护机制进行了一些深入的研究，以期在药理上为脑损伤保护剂的研究提供一些新思路。有学者综合研究结果说明，CCK与NGF在神经系统的保护和修复方面有密切的相关性[8]。学者们公认的是，NGF对脑的正常发育和功能维持起着重要作用[9]。已有许多研究发现，NGF对缺氧缺血性脑损伤有抑制损伤程度、促进损伤修复的作用，是人们较为熟知的神经保护因子。由于NGF不能通过血脑屏障，需采用颅内插管或输注泵的方式脑内给药，此为创伤性操作且副反应较大，因此采用CCK-8促进NGF合成和表达，从而达到神经保护和修复的功效，这对缺血缺氧性脑损伤来说是一种新疗法的尝试。目前，CCK和NGF的药理学研究都还在试验阶段，人们在细胞水平及器官水平、离体及在体方面对二者的相关性等进行了大量的临床研究，人们对CCK神经保护作用机制也会有更深入的研究，为CCK在今后的临床治疗和药理应用提供更多的理论和实验依据。

综上所述，CCK-8能够抑制缺氧缺血细胞模型凋亡，减轻神经细胞损伤的程度，其神经保护机制与促进NGF蛋白及NGF mRNA表达增加有关。

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[3]徐培,陶尚敏.海马胆囊收缩素对大鼠癫痫发作的影响及其机制[J].中国应用生理学杂志,2000,38(1):75-78.

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[9]付小兵.脑损伤后认知障碍及神经生长因子的脑保护作用[J].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(3):1-3.

Intervention effect of cholecystokinin-8 on hypoxic-ischemic cell damage model.

LIU Ying,ZHOU Jiang-bao. Department of Paediatrics,Panzhihua Maternal and Child Health-Care Hospital of Sichuan Province,Panzhihua 617000, Sichuan,CHINA

ObjectiveTo investigate the intervention effect of cholecystokinin-8(CCK-8)on hypoxic-ischemic cell damage model,and to explore its effect on expression of nerve growth factor(NGF)protein and NGF mRNA in the neurons during apoptosis.MethodsNeonatal rat cerebral cortical neurons cultured in vitro for 7 d were selected as the blank control group(group A).Hypoxic-ischemic cell damage models(group B)were established by 50 mol/L glutamic acid soaking.The models treated with 1×10-6mol/L,1×10-7mol/L,1×10-8mol/L were enrolled as group C,D,E, respectively,followed by continuous culture for 24 h.The apoptosis rate of the cells of five groups was detected by in situ end labeling technique,and the expression of NGF protein was detected by immunocytochemistry.The expression of NGF mRNA was detected by in situ hybridization technique.ResultsThe apoptosis rate of group A,group C and group D were respectively(8.49±4.54)%,(3.87±5.64)%and(7.84±4.19)%,which were significantly lower than(17.53± 6.93)%in group B(P＜0.05).The apoptosis rate of group E was(13.27±3.41)%,which showed no significant difference with(17.53±6.93)%in group B(P＞0.05).The expression of NGF protein was not detected in the group A(OD value:0). NGF protein expression was significantly increased in group C(OD value:0.343 2±0.006 81)and group D(OD value: 0.301 2±0.001 87)than that in group B(OD value:0.283 7±0.007 69),and the differences were statistically significant (P＜0.05).There were no significant differences between group E(OD value:0.275 2±0.003 73)and group B(P＞0.05). There was a small amount of NGF mRNA expression in the group A(OD value:0.286 6±0.004 41).NGF mRNA expression were significantly increased in group C(OD value:0.347 4±0.010 04)and group D(OD value:0.329 4±0.019 22) than group B(OD value:0.301 2±0.001 87),and the differences were statistically significant(P＜0.05).There were no significant differences in NGF mRNA expression between group E(OD value:0.296 8±0.003 78)and group B(P＞0.05). ConclusionCCK-8 can suppress apoptosis of hypoxic-ischemic cell damage model,which neuroprotective mechanism was related to the increased expression of NGF protein and NGF mRNA.

Cholecystokinin;Apoptosis;Intervention

R-332

A

1003—6350（2017）02—0180—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.003

2016-07-03)

周江堡。E-mail：zhoujb1115@yahoo.com.cn