干细胞源性外泌体在心血管疾病中的研究进展

陈 嫚，许官学

·综 述·

干细胞源性外泌体在心血管疾病中的研究进展

陈 嫚，许官学

外泌体；干细胞移植；心血管疾病；综述

近年来，干细胞源性外泌体作为非细胞体系对心肌细胞的修复作用逐渐被大家认知。由于经皮冠状动脉介入治疗及外科旁路移植手术的发展，急性心肌梗死(acute myocardial infarction， AMI)患者的存活率显著提高。然而，功能性心肌细胞丢失所致的心室重塑使幸存的AMI患者最终发展为心力衰竭(心衰)，远期预后不容乐观。剩余心脏组织有限的增殖及分化能力使得心脏结构再生面临极大挑战，心脏移植仍然是难治性心衰的最佳治疗手段。研究者为改善AMI及缺血性心衰患者的预后做了诸多尝试，其中干细胞移植被认为是治疗心血管疾病最具前景的方法。目前已有大量基于动物模型的研究证实了多种干细胞移植的有效性，其中包括骨髓间充质干细胞、心脏干细胞(cardiac progenitor cells, CPC)、胚胎干细胞等[1-6]。新近研究发现，相比直接增殖分化为心脏谱系细胞，AMI后移植的干细胞通过旁分泌效应对梗死后心脏的保护作用更加明显[7]。干细胞源性外泌体作为非细胞治疗策略在心血管领域掀起了研究热潮[8]，其对心血管疾病的发生、发展及对心脏的保护作用逐渐被人们认知，本文复习相关文献综述如下。

1 外泌体的生物学特征

1.1 概念与起源 外泌体是在研究正常细胞和肿瘤细胞脱落小体时首次提出，数年后Johnstone等[9]在研究网织红细胞成熟过程中首次分离提纯。随着研究的深入，人们发现除了肿瘤细胞及网织红细胞等细胞外，心脏谱系细胞如骨髓间充质干细胞、CPC、胚胎干细胞、内皮祖细胞及诱导多能干细胞等均可释放外泌体。目前多认为外泌体来源于细胞膜向内出芽所形成的细胞核内体，细胞核内体进一步包裹胞浆内mRNA、miRNA、蛋白质诸如此类的遗传物质，形成包含腔内小体的细胞核内体(多泡体)，多泡体与细胞膜融合并通过胞吐方式释放至细胞外环境，最终形成外泌体[10]。

干细胞源性外泌体具有与其母体干细胞相似的生物功能，包含有大量与其功能相关的遗传物质[11-12]。其中，miRNA是近年来受到广泛关注的一种内源性高度保守的小分子非编码单链RNA，可在mRNA水平及蛋白翻译过程中调节多种疾病的发生发展进程[13]。研究显示，外泌体内miRNA的含量明显高于在母体干细胞中的含量，且据母体干细胞特性，外泌体内会出现某种特定miRNA聚集现象[14]。外泌体作用于受体细胞后，可经向受体细胞或组织传递特异性遗传物质，进而改变受体细胞或组织的生物学特征[15]。

1.2 生物学特征 外泌体是直径介于30～100 nm的膜状小体，并且外泌体质膜及其内部富含大量与其发挥生物学效应密切相关的蛋白质，目前研究较为明确的有：①转膜蛋白和融合蛋白(Rab GTPases、flotillin、膜联蛋白)；②细胞内源性蛋白(Alix、TSG101)；③整合素和4次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)，热休克蛋白(HSP70、HSP90)；④脂质相关蛋白和磷脂酶；⑤与外泌体母细胞性质密切相关的特异性蛋白[16]。

2 外泌体与干细胞旁分泌效应

干细胞移植被认为是治疗心血管疾病最具前景的方法，既往研究认为干细胞主要通过直接分化为心肌细胞而发挥效应。然而van Berlo等[17]研究发现，小鼠体内心脏固有干细胞直接分化成新心肌细胞的比例为0.003%或更低，并对CPC的直接分化效应产生了质疑。此外，有实验结果显示，向大鼠梗死心肌内注射CPC培养液亦可减少心肌瘢痕组织，主要作用机制为外源性CPC通过旁分泌HGF、IGF-1、VEGF、β-FGF、SDF-1等细胞因子，以募集固有CPC并促进其迁移、生存、增殖、分化，发挥促进血管新生和抗凋亡的作用，从而改善心脏功能[18]。Lai等[19]通过分子体积、电镜观察、超速离心、质谱分析以及生化研究等方法，从干细胞培养液中提取出外泌体，并证实干细胞源性外泌体能够有效减少小鼠AMI后的心肌梗死面积。新近研究发现，特异性去除CPC培养液中的外泌体可明显减弱其对心脏的保护效应[20]。同样的，去除外泌体可减少缺血预处理所调控缺血再灌注区的冠状动脉灌流量[21]。这些研究均表明外泌体是干细胞旁分泌效应及缺血预处理心脏细胞的活性组分。目前，外泌体作为干细胞旁分泌效应的典型代表，在调控细胞信号传递、调节疾病生物学行为中的作用受到广泛关注。

3 干细胞源性外泌体在心血管疾病中的研究

3.1 间充质干细胞源性外泌体(mesenchymal stem cells derived exosomes， MSC-exosomes) 大量临床前研究已证实MSC-exosomes在治疗心血管疾病中的效果。Arslan等[22]研究发现，人胚胎干细胞源性间充质干细胞(human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells, ESC-MSCs)内包含有与外泌体高度吻合的直径为50～100 nm的微小颗粒；向缺血再灌注小鼠模型输入外泌体可明显减少AMI面积；进一步将ESC-MSCs中提取的外泌体注入AMI小鼠模型中发现其心功能明显改善。此外，有学者发现AMI后心脏组织中ATP及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平显著升高，然而用外泌体处理后其活性氧水平降低；并进一步证明经外泌体处理后心脏组织中磷水解磷酸化AKT及糖原合成酶激酶-3显著升高，而c-jun氨基末端激酶显著降低[19]。Bian等[23]证明MSC-exosomes可明显减少AMI兔模型心肌梗死面积，促进梗死周围新生血管形成，改善心脏功能。Yu等[24]首先发现在MSCs中过表达锌指转录因子-4(GATA1 binding factor-4， GATA-4)，然后再把提取的外泌体作用于AMI兔模型，发现MSC GATA-4-exosomes可明显减少心肌梗死面积；并进一步发现MSC GATA-4-exosomes内富含大量miRs，特别是miR-19a，其含量比在MSC-exosomes中多；并证明miR-19a可下调磷酸酶及PTEN进而激活抗凋亡的AKT及细胞外信号调节激酶。Feng等[25]发现，缺血预处理小鼠MSC-exosomes内含有大量miR-22，当AMI时富含miR-22的外泌体可经下调甲基化CpG结合蛋白-2发挥抗心肌细胞凋亡作用。

3.2 心脏干细胞源性外泌体(cardiac progenitor cells derived exosomes， CPC-exosomes) Chen等[26]研究发现，小鼠CPC-exosomes可显著抑制缺血再灌注损伤小鼠模型心肌细胞的凋亡。此外Barile等[27]证明，人CPC-exosomes可明显抑制大鼠AMI后心肌细胞凋亡，促进梗死心肌周围新生血管形成，改善AMI后心脏功能；进一步研究证明，CPC-exosomes内富含miR-210、miR-132及miR-146a-3p，其强大的抗心肌细胞凋亡和促血管生成效应，与高表达的miRNA激活下游靶蛋白ephrin A3、PTP1b及RasGaP-p120密切相关。Ibrahim等[28]在AMI小鼠模型的研究中也发现，CPC-exosomes可抑制心肌细胞凋亡，促进新生血管形成，改善心脏功能；并证明CPC-exosomes含有丰富的miR-146a，其主要通过miR-146a发挥心脏保护效应。此外，研究证明CPC-exosomes可改变成纤维细胞分泌活性，可使成纤维细胞分泌更多的基质细胞衍生因子-1及血管内皮生长因子，明显改变成纤维细胞内miR的组分；向AMI大鼠模型心脏中移植CPC-exosomes预处理的成纤维细胞，可明显改善其心脏泵血功能、增加血管生成密度及减少瘢痕组织面积[29]。新近研究发现缺氧可促进小鼠CPC-exosomes的释放并改变其内遗传物质的构成，缺氧的CPC-exosomes作用于缺血的心脏组织后可显著降低组织生长因子、波形蛋白、I型及Ⅲ型胶原蛋白的表达；进一步研究发现缺氧的CPC-exosomes miR-17、miR-199a、miR-210及miR-292表达增高，并且这些miR可作用于涉及纤维化通路的靶基因发挥心功能保护作用[30]。Ong等[31]经基因芯片分析发现，过表达HIF-1的CPC所分泌的外泌体含有大量具有心脏保护作用的miR-126及miR-210，且通过向受体Sca1+CPC传递miR-126及miR-210，使Sca1+CPC内促存活激酶激活，进一步降低代谢能量需求，提高Sca1+CPC对缺氧的耐受能力，改善AMI后Sca1+CPC移植的效果。

3.3 胚胎干细胞源性外泌体(embryonic stem cells derived exosomes， ESC-exosomes)及诱导多能干细胞源性外泌体(induced pluripotent stem cells derived exosomes， iPS-exosomes) Arslan等[22]在ESC-exosomes的研究中发现，外泌体具有促进心脏增生反应的特异能力。ESC-exosomes富含脂质相关蛋白flotillin-1、多能性mRNA 转录本及miRNA-290；在氧化应激状态下可通过向受体细胞传递外泌体内容物促进细胞增殖、存活及提高血管生成能力；AMI后心肌内注入ESC-exosomes可通过促进血管生成进一步增强心脏细胞增生能力，显著改善心脏功能；进一步发现向AMI小鼠模型注入ESC-exosomes后可促进新生血管形成，提高心肌细胞存活率，减少心肌梗死面积；进一步证实ESC-exosomes可促进CPC存活及增殖，并发现ESC-exosomes含有大量miR-294、miR-294，可使CPC细胞周期向S期发展，说明ESC-exosomes主要通过向靶细胞传递miR-294等特异性miRs进一步发挥促细胞增殖及存活效应。

Wang等[32]证明，iPS-exosomes在缺血损伤状态下可通过传递miR-21及miR-210促进心肌细胞存活，体外研究进一步发现，iPS-exosomes可通过抑制caspase 3/7的激活从而抑制过氧化氢诱导的氧化应激状态下H9C2心肌细胞凋亡；此外，iPS-exosomes处理缺血再灌注损伤的大鼠心脏组织24 h后发现，TUNEL+/肌钙蛋白I+的心肌细胞数量显著下降。提示iPS-exosomes对缺血再灌注损伤状态下心肌细胞具有保护效应。

4 展望

外泌体作为干细胞旁分泌效应的重要组成，可向靶细胞传递特异性miRNAs、mRNAs及蛋白，发挥促进细胞存活、增殖及血管生成效应。本文众多文献均证实了外泌体在心肌梗死后可对抗心肌缺血所致的心肌细胞凋亡及细胞增殖受限，并经促新生血管形成、抑制心脏纤维化等途径改善心脏泵血功能。外泌体的这些特性使其有望成为AMI后心肌再生修复治疗的新策略。尽管目前外泌体用于治疗心血管疾病的临床试验还未进行，但其用于肿瘤患者的免疫疗法已经开始I期临床试验，业已证明有良好的应用安全性[33-34]。相信不久的将来，干细胞源性外泌体治疗心血管疾病的有效性及安全性将得到证实,为心血管疾病患者带来福音。

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563003 贵州 遵义，遵义医学院附属医院心血管内科

许官学，E-mail:xuguanxue2008@163.com

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A

1002-3429(2017)07-0107-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.07.033

2016-12-28 修回时间：2017-05-12)