白细胞介素-1β促进人真皮成纤维细胞分泌促血管生成及炎症因子

潘毛毛，吕婷，张洁尘，聂舒，缪飞，王宏伟

复旦大学附属华东医院皮肤科，上海200040

白细胞介素-1β促进人真皮成纤维细胞分泌促血管生成及炎症因子

潘毛毛，吕婷，张洁尘，聂舒，缪飞，王宏伟

复旦大学附属华东医院皮肤科，上海200040

目的探讨IL-1对人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblast，HDF）的细胞抑制率、促血管生成因子和炎症因子分泌的影响。方法CCK8法检测不同浓度IL-1对HDF的细胞抑制率，ELISA法检测3，10ng/m L IL-1处理HDF 24h后上清中血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子（FGF）、IL-6的表达。结果0.3、1、3、10ng/m L IL-1对HDF的抑制率分别为（1.22±0.78）%，（3.72±1.21）%，（9.10±2.60）%，（14.42±3.36）%。3、10ng/m L IL-1作用于HDF 24h后，两组上清的VEGF、FGF水平较空白对照组均升高（FGF<0.05，VEGF<0.01），3，10ng/m l IL-1两个浓度组间无统计学差异。3、10ng/m L IL-1两组HDF上清中IL-6浓度较空白对照组均增加（<0.05，<0.001），且10ng/ m L IL-1组较3ng/m L组IL-6浓度更高，有统计学差异(<0.001)。结论IL-1可促进HDF分泌VEGF、FGF和IL-6，提示IL-1可能通过促进成纤维细胞分泌促血管生成和炎症因子，进而促进肿瘤生成、浸润和转移。

人真皮成纤维细胞；白介素-1；成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；白介素-6

成纤维细胞，作为合成、重塑细胞外基质的主要效应细胞，还通过分泌生长因子和机械收缩，支持血管生成和肿瘤细胞的侵袭和转移[1]。白细胞介素-1 (interleukin1，IL-1)参与活化正常成纤维细胞，使其表达肿瘤间质成纤维细胞的特异性标志蛋白，促进肿瘤进展[2]。IL-1能促进内皮细胞和主动脉平滑肌细胞内皮血管生长因子(vascularendothelialgrow th factor，VEGF)及其受体的表达，在肿瘤介导的血管生成中发挥重要作用[3,4]。目前IL-1是否通过成纤维细胞分泌可溶性细胞因子，参与肿瘤血管生成和慢性炎症反应尚不清楚，故本研究拟通过观察IL-1对体外培养的人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblast cell，HDF）分泌VEGF、FGF、IL-6的影响，初步探讨IL-1对成纤维细胞分泌促血管生成因子及炎症因子的影响，为进一步完善IL-1通过成纤维细胞促进肿瘤血管生成和进展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及来源HDF、成纤维细胞培养基FM购自ScienCell公司；DMEM高糖培养基购自HyClone公司；胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA购自Gibco公司；青霉素-链霉素购自Invitrogen-Gibco公司；人重组IL-1 10g购自PeproTech公司；human VEGF、IL-6ValukineELISA试剂盒购自R＆D公司；human FGFELISA试剂盒、CCK8试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HDF细胞培养HDF置于含2%FBS、1%FGS、1%青霉素-链霉素的成纤维细胞培养基中，37℃，5% CO2常规培养，待细胞长满至80%左右胰酶消化2m in，800r/min，5min离心收集下层细胞，1∶2传代培养。

1.2.2 CCK-8检测IL-1对HDF细胞抑制率：HDF以6×104个/m L，100L/孔的密度铺96孔板，37℃，5% CO2培养箱中预培养24h，加入10L不同浓度（0.3，1，3，10ng/m L）的IL-1与细胞共孵育24h，加入CCK8试剂10L/孔，孵育90m in酶标仪检测450 nm处的OD值。细胞抑制率=（[对照组-实验组）/（对照组-空白组）]×100%

1.2.3 HDF上清液的制备 无血清DMEM重悬混匀HDF细胞，细胞计数后按3×105个/m L，1m L/孔的密度铺12孔板，37℃，5%CO2常规培养24h。第2天12孔板HDF细胞弃上清，PBS冲洗2次，添加（空白对照组不添加，低浓度LC组3ng/m L，高浓度HC组10ng/m L）人重组IL-1的无血清DMEM培养液各1m L，37℃，5%CO2作用24h。第3天收集上清，4℃，3 000g，15m in离心，小心吸取上层液体，行双抗体夹心ELISA法检测细胞因子。

1.2.4 细胞因子的测定采用ELISA试剂盒测定细胞上清中FGF、VEGF、IL-6水平，严格按说明书进行操作：准备洗涤剂、稀释剂、标准品母液，加入标准品

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 5软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示，各组数据用单因素方差分析，<0.05认为有统计学差异。

2 结果

2.1 IL-1对HDF的形态改变和细胞抑制率200倍显微镜下观察细胞形态，在0.3，1ng/m L IL-1刺激下，细胞形态与对照组无差异；在3，10ng/m L IL-1刺激下，HDF折光性增强，边界锐化，细胞间连接增多，更向长梭形发展，未见凋亡细胞。0.3，1，3，10ng/ m L IL-1对HDF的抑制率分别为（1.22±0.78）%，（3.72±1.21）%，（9.10±2.60）%，（14.42±3.36）%，均不超过15%，见图1。

图1 不同浓度IL-1处理HDF24 h后的细胞形态和细胞抑制率

2.2 IL-1对HDF分泌促血管因子的影响低浓度LC组和高浓度HC组3，10ng/m l的IL-1作用于HDF24h后，两组上清的FGF水平均升高，与空白对照组比较差异有统计学意义（=5.159，<0.05），低浓度LC组和高浓度HC组组间差异无统计学意义。LC组和HC组3，10ng/m l的IL-1作用于HDF24h后，两组上清的VEGF水平均升高，与空白对照组比较差异有统计学意义（=16.23，<0.01），低浓度LC组和高浓度HC组组间差异无统计学意义，见图2。

2.3 IL-1对HDF分泌IL-6的影响LC组和HC组3，10ng/m L的IL-1作用于HDF 24h后，上清中IL-6浓度与对照组相比均升高，差异有统计学意义（=50.59，LC组<0.05，HC组<0.001），高浓度的HC组与低浓度LC组相比HDF上清中IL-6升高，差异有统计学意义(<0.001)，见图3。

图2 不同浓度IL-1作用HDF 24 h后上清HGF、VEGF浓度

3 讨论

肿瘤间质成纤维细胞，通过直接接触肿瘤细胞或者分泌可溶性成分，促进血管形成、肿瘤细胞存活和上皮-间质转换(epithelia-mechenchymal transition, EMT)，从而导致肿瘤发生、侵袭和转移，是一个极具吸引力的降低肿瘤耐药和复发的治疗靶点[5]。皮肤肿瘤间质成纤维细胞的原代培养存在标本难获得、培养过程复杂、细胞不能稳定传代等缺点，而肿瘤间质成纤维细胞是由正常成纤维细胞活化而来，因此我们选用HDF替代肿瘤间质成纤维细胞，初步探讨IL-1对体外培养的HDF的作用。

图3 不同浓度IL-1作用HDF 24 h后上清IL-6浓度

Seok Lee等[6]研究发现IL-1能促进类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖，且具有浓度依赖性。我们为了筛选适宜的IL-1作用浓度，检测常用实验浓度IL-1对HDF的细胞抑制率，发现3，10ng/m L的IL-1对HDF的细胞抑制率均不足15%，且形态学上激活成纤维细胞，所以后续实验我们采用以上两个浓度。与既往研究不同，本实验未发现IL-1对HDF有促增殖作用，可能与选择的成纤维细胞类型、具体浓度不同有关。

VEGF和FGF在脐静脉内皮细胞和鸡胚胎绒毛膜实验的初试活化阶段有协同作用，促进内皮细胞的增殖、迁移、分化和基质降解，是肿瘤血管生成关键的促血管生长因子[7]。KIM等[8]研究显示1ng/m L的IL-1刺激内皮细胞和滑膜细胞24h后，上清中VEGF增加。我们研究发现3，10ng/m L的IL-1刺激HDF增强分泌VEGF、FGF，提示IL-1可以促进成纤维细胞参与血管生成和发展，与其他学者研究结果类似，推测在皮肤肿瘤中，IL-1诱导肿瘤微环境中各种成纤维细胞（包括肌成纤维细胞、肿瘤间质成纤维细胞等活化的成纤维细胞）分泌多种促血管生成因子，直接促进肿瘤血管生成，并参与构建促瘤的肿瘤微环境。

最新研究证实IL-6升高与口咽部鳞癌、食管鳞癌预后不良和早期复发高度相关，IL-6主要通过JAK/ STAT3通路介导EMT，也通过VEGF增强了血管和淋巴管生成，从而促进肿瘤的进展[9]。Paik等[10]研究显示眼眶成纤维细胞在10ng/m L IL-1刺激24h后分泌的IL-6浓度增强13倍。诸多研究表明，IL-1诱导风湿性关节炎滑膜成纤维细胞合成IL-6[11]，本实验我们也观察到IL-1具有刺激HDF分泌IL-6的作用，而且高浓度组分泌水平高于低浓度组，可见IL-1促进HDF分泌IL-6可能存在浓度依赖性。本研究提示IL-1促进正常成纤维细胞成分泌大量IL-6，除了协同VEGF、FGF等参与肿瘤血管和淋巴管生成外，还可能通过IL-6诱导的EMT促进肿瘤转移和侵袭。

[1]Coleman DT,Gray AL,StephensCA,.Repurposed drug screen identifiescardiac glycosidesas inhibitorsof TGF--induced cancer-associated fibroblast differentiation[J].Oncotarget, 2016,7(22):32200-32209.

[2]Chen H,YangWW,WenQT,.TGF-beta induces fibroblast activation protein expression;fibroblast activation protein expression increases theproliferation,adhesion,andm igration of HO-8910PM[corrected[J].Exp Mol Pathol,2009,87(3): 189-194.

[3]Voronov E,Carm iY,ApteRN.The role IL-1 in tumor-mediated angiogenesis[J].FrontPhysiol,2014,5:114.

[4]Marech I,LeporiniC,AmmendolaM,.Classicaland nonclassicalproangiogenic factorsasa targetof antiangiogenic therapy in tumormicroenvironment[J].Cancer Lett,2016,380 (1):216-226.

[5]Shiga K,Hara M,Nagasaki T,.Cancer-Associated fibroblasts:their characteristicsand their roles in tumor grow th [J].Cancers(Basel),2015,7(4):2443-2458.

[6]LeeWS,Lim JH,Sung MS,.Ethylacetate fraction from Angelica sinensis inhibits IL-1-induced rheumatoid synovial fibroblastproliferationand COX-2,PGE2,and MMPsproduction [J].BiolRes,2014,47:41.

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IL-1 Promotes the Secretion of Angiogenic and Inflammatory Factors in Human Dermal Fibroblast

Pan Maomao,LüTing,Zhang Jiechen,Nie Shu,M iao Fei,Wang Hongwei*
Departmentof Dermatology,Huadong HospitalAffiliated to Fudan University,Shanghai,200040,P.R.China

Objective Toexplore the roleof interleukin-1(IL-1)in inhibiting thegrow th ofhuman dermal fibroblast (HDF)and in promoting HDFsecretion ofangiogenic and inflammatory factors.Methods CCK8wasapplied in detecting the grow th inhibiting rateof HDF treatedw ith IL-1 of differentconcentrationswhile ELISA wasapplied in detecting theexpression levelsofvascularendothelialgrow th factor(VEGF),fibroblastgrow th factor(FGF)and IL-6 in HDF treatedw ith 3and 10ng/ m L IL-1 for 24 hours.Results The grow th inhibiting rate of HDF treated w ith 0.3ng/m L IL-1,1 ng/m L IL-1,3 ng/m L IL-1 and 10ng/m L IL-1 was(1.22±0.78)%,(3.72±1.21)%,(9.10±2.60)%and(14.42±3.36)%respectively;theexpressions ofVEGFand FGFin3and 10ng/m l IL-1 group increased significantly andwerehigher than those inblank controlgroup(VEGF<0.01,FGF<0.05)while there existed no statisticaldifference in the expressionsbetween 3 and 10ng/m l IL-1 group;the expressions of IL-6 in 3 and 10ng/m l IL-1 group were higher than that in blank controlgroup<0.05,<0.001)while the expression of IL-6 in 10ng/m l IL-1 group wasmuch higher than that in 3ng/m l IL-1 group(<0.001).Conclusions IL-1 can promote HDFsecretion of VEGF,FGFand inflammatory cytokine IL-6,which indicates that IL-1 may promote the tumorigenesis,invasion andmetastasis..

human dermal fibroblast(HDF);interleukin-1(IL-1);fibroblastgrow th factor(FGF);vascular endothelialgrow th factor(VEGF);IL-6

2017-06-12）

（本文编辑：陈培莲）

国家自然科学基金（81572671）

王宏伟，hongweiwang2005@aliyun.com

*Corresponding author:Wang Hongwei,E-mail:hongweiwang2005@aliyun.com