食源性羧甲基赖氨酸的研究进展

刘慧琳，陈晓默，倪天鸿，王静

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京，100048）

食源性羧甲基赖氨酸的研究进展

刘慧琳，陈晓默，倪天鸿，王静

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京，100048）

羧甲基赖氨酸[Nε-（Carboxymethyl）lysine，CML]是美拉德产物之一，研究较多的是其在体内的积累与慢性疾病并发症的相关性。对于食源性CML的报道较少，本文从食源性CML的性质、来源、潜在危害，形成途径及检测方法进行阐述，提供一定的理论基础。

羧甲基赖氨酸；晚期糖基化终产物；形成途径；检测方法

美拉德反应是食品加热过程产生风味最重要的途径之一，是指氨基与羰基化合物缩合形成席夫碱，通过Amadori重排形成中间产物，进一步降解形成活性羰基，如乙醛酮，二羰基化合物，还原酮等，活性羰基与氨基组化合物反应生成类黑精或晚期糖基化终产物。目前已经发现的晚期糖基化终产物（Advanced glycation end products，AGEs）有20多种，其中包括羧甲基赖氨酸[Nε-（Carboxymethyl）lysine，CML]，羧乙基赖氨酸、戊糖素、吡咯素、丙烯酰胺等[1]。有大量研究表明，AGEs对人体具有潜在的危害性，在糖尿病及其并发症包括心血管疾病、白内障、肾衰竭和视网膜病等患者的血液、病变组织和尿液中都含有微量的晚期糖基化终产物[2-5]。

CML是目前研究最多的晚期糖基化终产物之一，Sharanya Reddy等证明由于CML的电荷密度和侧链极性，使它暴露在绝大多数AGEs的表面[6]，而成为一个易于识别的抗原表位，目前已经制备出CML的特异性单克隆抗体，用于AGEs的定位研究。因此，了解CML对认识AGEs有着重要的意义，研究CML的形成理论及检测方法为最终有效控制AGEs的产生提供理论依据。

1 食源性CM L的性质和来源

CML的化学式为C8H16O4N2，摩尔质量为204.22 g/mol，CML没有颜色，没有荧光特性，没有交联性，具有酸稳定性[7]，许多细胞表面都有其受体，CML可以通过这些受体影响细胞的功能。CML的结构式如图1所示。

图1 食源性CM L可能的形成途径Fig.1 The possible forming ways for food borne CML

大部分食品在加工过程中都会产生CML，尤其是在热加工过程中所涉及到的高蛋白高糖类高油脂食品。George L JHull等测定了257种不同西方常见食物中CML的含量，其中包括，奶制品，肉制品，饼干，米饭，汤，调味料，咖啡，水果和蔬菜等，结果发现奶制品中的CML的量最多，其含量会受温度、糖种类的影响，最高含量可达到5143.7mg/kg蛋白[8]。Pei-chun Chao等发现经过酱油调味的肉制品中CML的含量要明显高于未经处理的肉制品，其中未加工的肉制品CML的含量为10μg/100 g～76μg/100 g样品，而加入酱料后肉制品中CML的含量为1400μg/100 g～2926μg/100 g样品[9]。Jialiang He等测定了常见东方食品（包括，饼干、面包和油条）中CML的含量，其中，面包皮比面包心的CML的含量高，饼干中CML的含量最高达到117.53μg/100 g样品[10]。当食品原料中含蛋白质，糖类，油脂时有利于CML的形成，主要是因为这些成分是形成CML的前体物质。

2 食源性CM L的潜在危害

动物实验和临床实验表明，食源性CML对人体健康具有潜在的危害性。研究表明CML在人体内的积累和一些疾病，如心血管疾病，骨骼肌衰老和肾衰竭等的发病机理有关[11-14]。Yi-Chieh Li等探索了马兜铃酸肾病与甲基乙二醛（形成CML的中间产物）和CML积累的关系。通过连续5天向C3H/He小鼠体内注射马兜铃酸（10mg/kg）成功建立了马兜铃酸肾病小鼠模型。结果表明，肾脏匀浆中的甲基乙二醛的浓度比对照组高出了12倍（p＜0.01），通过免疫化学分析发现小鼠肾脏小管中存在CML。而且与对照组相比，谷胱甘肽水平降低了0.32倍，体内肾脏的抗氧化能力降低了0.54倍，说明马兜铃酸导致的肾损伤与甲基乙二醛和CML的增加和积累有关，在CML的形成过程中伴有自由基的生成，导致谷胱甘肽的氧化和肾脏抗氧化能力的降低[15]。

Wautier M P等探索了血清中AGEs的水平和CML含量的增加与Ⅱ型糖尿病并发症的相关性。通过免疫分析法测量了患有Ⅱ型糖尿病且患病年限为（11±8）年，年龄在58±6.1之间的51名男性和26名女性，和没有患有糖尿病的年龄在55.5±7.5之间的39名男性和21名女性的血清中AGEs的水平和CML的含量。结果表明Ⅱ型糖尿病人的血清中AGEs的水平和CML的含量明显高于对照组（P＜0.000 1），表明CML的含量与Ⅱ型糖尿病血管并发症有关[16]。

Casper G Schalkwijk等报道了CML与糖尿病并发症心脏衰竭疾病的相关性，研究结果表明，高血糖症会导致CML的增加，实验组心脏组织中的CML的量是对照组中CML量的六倍，CML加合物大量存在于糖尿病患者的心肌内的小动脉，糖尿病患者体内的CML在心脏的积累可能导致心脏衰竭的风险增加[17]。

Katarina Šebeková等分析了34个母乳喂养和25个配方奶粉喂养的6个月大的婴儿中的血浆和尿液中CML的含量以及56种母乳和16种配方奶粉中CML的含量。结果表明，配方奶粉中的CML的含量高于母乳（28倍～389倍），特别是水解后的配方奶粉中CML的含量高于不水解的奶粉，配方奶粉喂养的婴儿血浆中CML的水平高出母乳喂养婴儿的46%，尿液中CML的排出量高于母乳喂养婴儿的60倍，实验证明来自配方乳中的食源性CML会随食物参与到人体的吸收并进入血液循环系统[18]。

3 食源性CM L的形成理论

关于CML的形成路径研究较多，通过整理和总结，食源性CML的形成途径主要有以下五种，如图1所示。

1）Hodge路径：还原糖和氨基化合物（赖氨酸以及赖氨酸残基）形成席夫碱，席夫碱重排形成Amadori产物，最后Amadori产物裂解产生CML[19]。

2）Namiki路径：席夫碱裂解产生乙二醛（glyoxal，GO），GO与氨基化合物反应形成CML[20]。

3）Fu路径：脂质氧化生成GO，GO与氨基化合物反应形成CML[21]。

4）Wolf路径：葡萄糖氧化生成GO，再和氨基化合物反应形成CML[22]。

5）Dunn路径：抗坏血酸和氨基化合物形成席夫碱，席夫碱重排形成Amadori产物，最后Amadori产物裂解产生CML[23]。

从反应的底物来看，食源性CML来自三个方面，一方面来自AGEs—原料为糖和蛋白，另一方面为晚期脂质氧化终产物（Advanced lipid end products，ALES）—原料为油脂和蛋白，以及抗坏血酸途径—原料为抗坏血酸和蛋白。蛋白和还原糖形成席夫碱重排形成ARPs（Amadori products）和HRPs（Heyns products），当还原糖为多羟基醛时重排形成ARPs，当还原糖为多羟基酮时重排形成HRPs，Chou Srey等发现，HRPS可能比ARPs产生更多的CML[24]。席夫碱可以裂解形成GO，还原糖和脂质也可以氧化裂解形成GO，其中GO和ARPs是CML的直接中间产物。付全意[25]等利用同位素标记技术和多级动力学模型证明了这一观点，ARPs的活化能Ea低于GO，因此ARPs更易转化为CML。另外，选择抗坏血酸和赖氨酸为原料时，Amadori产物为苏阿糖赖氨酸[23]。韩立鹏等研究发现脂质可以氧化生成GO进而促进CML的形成，然而脂质也可以通过促使反应体系产生更多的·OH从而促进CML的生成[26]。

4 食源性CM L的检测方法

食源性CML的检测方法分为免疫法、仪器分析法和荧光传感检测法。免疫法主要是酶联免疫吸附法（ELISA）；仪器分析法包括：液相-荧光检测法（high performance chromatography-fluorescence，HPLC-fluorescence）、气相-质谱检测法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色谱串联质谱（high performance chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）、超高液相色谱串联质谱（ultra pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）等；荧光传感检测法是基于荧光纳米材料开发的一系列快速传感检测方法，通常使用的荧光纳米材料是指半导体量子点。

4.1 酶联免疫吸附法

ELISA法主要是利用抗原与抗体之间的特异性共价结合对抗原或者抗体进行定量的一种分析方法，Teresia Goldberg等利用CML的单克隆抗体（4G9）对250种食物中CML的含量进行了测定，结果表明，脂肪组的食物中CML的含量最高为（100±19）kU/g蛋白，其中食品CML的含量用kU/g蛋白或者kU/mL蛋白来表示[27]。Ralf Dittrich等也利用ELISA法测定了32位健康母亲的血清和母乳中CML的含量，结果表明，CML可以通过血清转移到母乳，其中CML的含量用ng/mL蛋白表示[28]。ELISA法操作简单，特异性强，结果易于观察，但是由于食品基质化学成分复杂，会对结果产生干扰，降低了准确性，所以对于食源性CML的检测一般采用仪器法检测。

4.2 高效液相色谱荧光检测法

CML没有荧光特性，直接用HPLC-荧光法无法检测，但是如果将CML进行柱前衍生使其生成荧光物质，再根据后生物的量就可以确定CML的量，S.Drusch等用HPLC-fluorescence测定了不同牛奶和奶酪样品中CML的含量，将样品进行硼氢化钠还原后再进行酸水解之后，用邻苯二胺（OPA）进行柱前衍生后上样检测，该方法的检测限（LOD）是0.5 pmol，定量限（LOQ）为1.1 pmol，该方法的重现性为2.81%，有较高的灵敏度[29]。Pei-chun Chao等也用了HPLC-fluorescence法对酱制品以及酱制品处理的食物中CML的含量进行测定，结果表明，加入酱制品的食物中CML的含量会显著升高[9]。HPLC-fluorescence法重现性好，但是必须进行柱前衍生，操作繁琐，无法实现CML的即时定量。

4.3 气相-质谱检测法

Jing Wang等利用GC-MS法测定了大菱鲆肌肉中CML的含量，首先对样品进行前处理包括脱脂、还原、水解、净化然后进行双衍生，分别对羧基和氨基进行酯化和酰化，选择SIM（选择离子监测）模式对CML进行定量，结果表明，CML三氟乙酰甲酯化衍生物峰面积与浓度在1μg/L～200μg/L范围内呈良好线性关系，方法检出限为1mg/kg，定量限为5mg/kg，与酶联免疫方法相比，GC-MS法避免了酶联免疫法的假阳性，能够更加准确地对鱼类肌肉中的CML进行定性和定量分析，灵敏度更高，检测结果易与其它方法进行比较，是检测大菱鲆肌肉中CML含量的较好方法[30]。

4.4 液相-质谱检测法

质谱法选用多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，对食品中的CML进行定性定量，Jialiang He等利用LC-MS/MS的方法测定了不同谷物食品中CML的含量，得到CML的定量限为4 ng/g，能够有效的检测出较低含量的食源性CML，而且不需要复杂的衍生化过程即可检测，保证了样品中CML含量检测的即时性[10]。孙晓华等利用UPLC-MS/MS测定了不同品种和来源的油条中CML的含量，选用电喷雾正离子（ESI+）模式电离，多反应监测模式（MRM）进行串联质谱分析，仪器检出限为1μg/L，定量限为3μg/L。应用该方法测得15种不同来源的油条中CML含量为（69.3±8.2）mg/kg蛋白～（182.2±3.1）mg/kg蛋白（5.3± 0.5）mg/kg样品～（15.4±0.3）mg/kg样品。本方法操作简便、快速、灵敏度高、精密度好，为进一步研究食品中CML的产生机理提供了有效的检测方法[31]。

4.5 荧光传感检测法

基于半导体纳米材料——量子点所建立的CML荧光传感体系，是近年来所开发的简单、快速、灵敏的检测方法。Huilin Liu等以量子点为荧光核心，建立了CML分子印迹聚合物，以3-氨丙基-3-乙氧基硅烷为功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，检测了面包、牛奶及婴幼儿配方奶粉中CML的含量。该方法线性范围为5μg/L～400μg/L，检出限为2.6μg/L。在此基础上，为了提高CML的传感吸附时间，该课题组将超薄且比表面积较大的纳米材料石墨烯材料引入到CML荧光印迹传感体系中，该研究表明，石墨烯敏化的荧光印迹传感体系具有较好的吸附效果。该方法前处理简单，不需要复杂的除杂质过程，仅需将牛奶、奶粉等样品用水稀释，且可以同时检测96个样品，检测快速，可以弥补仪器检测方法的不足。但这种荧光传感检测方法的检出限略高，对于实际样品中痕量CML残留的检测能力还有待进一步提升[32]。

4 结论

食品加工过程中产生的化学危害物，通常是食品产业中长期存在的重大安全隐患，与人类多种慢性疾病和癌症的发生密切相关，是全人类需要解决的共性问题。AGEs是食品加工过程中产生的一类有害物质，不仅降低了食品的营养价值而且与糖尿病及其并发症有关联，CML是AGEs中从化学和生物学角度研究的最彻底的一种产物，本论文总结了食源性CML的基本性质，主要来源，存在的危害，可以有效的从来源上减少CML的摄入，关于食源性CML形成机理目前尚不明确，需要更进一步的研究和模拟实验，而且不同的检测方法的检测结果和检测限会有所差异，需要确定一种有效的统一检测标准，从而才能准确的比较不同食品中CML的含量，有效控制食源性CML的摄入量。

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Research Progress of Food-borne Nε-（Carboxymethyl）lysine

LIU Hui-lin，CHEN Xiao-mo，NI Tian-hong，WANG Jing
（Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology&Business University，Beijing 100048，China）

Nε-（Carboxymethyl）lysine（CML）is one of the most widely studied Maillard reaction products. There is a lot of research on the relationship between CML accumulation and many chronic diseases in vivo.But the report on food borne CML is less.In this paper，the nature and origin，the potential harm to the humans，the ways of formation，and the detection methods of the food borne CML were systematically expounded.It is a theoretical basis for the CML formation and control.

Nε-（Carboxymethyl）lysine；advanced glycation end products；formation pathways；detection methods

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.050

2016-10-21

刘慧琳（1987—），女（汉），讲师，博士研究生，研究方向：食品安全。