基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法检测猪霍乱沙门氏菌

黄震　夏诗琪　刘道峰　刘成伟　赖卫华

摘要建立了基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法，检测猪霍乱沙门氏菌。待检样品经免疫磁分离富集和热洗脱处理后，用荧光微球免疫层析试纸条进行检测。每毫克纳米磁珠标记30 μg抗体制备的免疫磁珠，对浓度为102～106 CFU/mL 的猪霍乱沙门氏菌的捕获率均大于90%，特异性好； 在pH=6时，以300 μg/mg猪霍乱沙门氏菌单抗11D8D4标记荧光微球，制备免疫荧光微球； 以2.0 mg/mL猪霍乱沙门氏菌单抗5F11B11喷涂检测线（T线），以1.0 mg/mL驴抗鼠IgG喷涂质控线（C线），制备免疫层析试纸条。采用建立的基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析方法检测猪霍乱沙门氏菌，在PBS缓冲液中检出限为1.5×105 CFU/mL，牛奶中检出限为7.6×105 CFU/mL，与直接采用荧光微球免疫层析方法检测相比，检出限分别降低了10倍和200倍。本方法可有效富集牛奶中的沙门氏菌，避免了基质干扰，灵敏度大大提高，具有较好的应用前景。

关键词免疫磁分离； 荧光微球； 免疫层析； 猪霍乱沙门氏菌

1引 言

沙门氏菌是一类能够导致人畜共患疾病的食源性致病菌[1]，可以引起肠胃炎、伤寒、败血症等多种疾病[2，3]。传统的沙门氏菌检测方法，需经过前增菌、选择性增菌、分离培养等过程，费时（5～7天）费力[4]。而其它检测方法，如聚合酶链式反应[5]、电化学法[6]、酶联免疫吸附法[7]和石英晶体微天平法[8]等，虽然灵敏度较高，但操作繁琐，难以满足现场检测的需求。

免疫层析法具有简便、快速和灵敏等优势，已广泛应用于食品安全[9]、医学检验[10]和环境检测[11]等领域。荧光微球（Fluorescent microspheres， FMs）为发射光谱类的新型标记物，能有效消除背景干扰[12]，提高检测灵敏度[13～15]。但荧光微球免疫层析方法（FM lateral flow assay， FMLFA）用于实际样品的检测时，常由于目标菌浓度低、基质成分复杂，对检测结果有较大的影响[16，17]。

免疫磁分离（Immunomagnetic separation， IMS）利用免疫磁性材料的磁性和特异性，在外加磁场作用下，将基质中的目标物分离、富集[18]。此方法能有效浓缩目标物，避免基质对检测过程的干扰，因此常作为食品、医学、环境检测中的前处理手段[19，20]。

目前，已有集成IMS和胶体金免疫层析方法的报道[21，22]，与传统胶体金免疫层析方法相比，此方法的灵敏度更高，检出时间更短，但灵敏度偏低[23]，因此，将高灵敏的荧光微球免疫层析法与IMS结合，有望进一步提高方法的检测灵敏度。本研究建立了基于IMS的FMLFA法检测猪霍乱沙门氏菌的方法，对于食品中食源性致病菌的检测具有重要参考意义。

2实验部分

2.1仪器与试剂

荧光微球试纸条读取仪（上海互帼科学仪器有限公司）； XYZB3050噴点平台（美国BIODOT公司）； HGS201切条机（杭州峰航科技有限公司）。

表面羧基化的荧光微球（直径175 nm，最大激发波长470 nm，最大发射波长525 nm，10 mg/mL， 德国默克公司）； 表面羧基化的磁珠（Magnetic nanobeads， MNBs， 上海奥润微纳新材料科技有限公司，直径180 nm，10 mg/mL）； 抗猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体11D8D4、5F11B11（实验室自制）[22]； 驴抗鼠IgG （北京中杉金桥生物技术有限公司）； PVC底板、聚酯膜、吸水纸（上海金标生物技术有限公司）； 牛血清蛋白（BSA，Amresco公司）； 酪蛋白（美国Sigma公司）； 硝酸纤维素膜（NC膜，德国Sartorius公司）； BCA蛋白微量定量试剂盒（美国赛默飞公司）； 1（3二甲氨基丙基）3乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N羟基硫代琥珀酰亚胺（NHSS）、2（N吗啉）乙磺酸（MES）等化学试剂均为分析纯，购于上海阿拉丁试剂有限公司； 牛奶购自本地超市。

猪霍乱沙门氏菌（ATCC 10708）、甲型副伤寒沙门氏菌（ATCC9150）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 13311）、肠炎沙门氏菌（ATCC 13076）、鸭沙门氏菌（ATCC 9270）、普通大肠杆菌（ATCC 25922）、大肠杆菌O157∶H7（ATCC 43888）、阪崎肠杆菌（CMCC 45401）、单增李斯特菌（ATCC 13932）、枯草芽孢杆菌（BD168， 菌株来自江西省疾病预防控制中心）、普通变形杆菌（CMCC 49027）、蜡样芽孢杆菌（CMCC 63305）、福氏志贺氏菌（CMCC 2457）、藤黄微球菌（CMCC 28001）保存于本实验室。

2.2免疫磁珠的制备与优化

2.2.1免疫磁珠的制备取100 μL磁珠母液，用MEST缓冲液（0.01 mol/L MES，pH 5.5，0.02% Tween20）洗涤3次。加入1 mL新配制的10 mg/mL的EDC和NHSS溶液重悬。室温下混旋，活化1 h后，磁分离，弃上清液，沉淀用1 mL 0.01 mol/L硼酸硼砂缓冲液（BS， pH 8.5）重悬。加入30 μg/mg（抗体/磁珠）单抗11D8D4，室温下混旋标记1 h，磁分离，弃上清液。沉淀以1 mL 含1% BSA的BS缓冲液重悬，室温下混旋封闭1 h。经磁分离弃上清液，沉淀用BST缓冲液（0.01 mol/L PBS，pH 8.5，0.02% Tween20）洗涤3次，以100 μL重悬液（0.01 mol/mL PBS，pH 8.5； 1% BSA； 5% 蔗糖； 3% 海藻糖； 0.05% PEG20000； 0.4% Tween20； 0.05% NaN3）重悬，4℃保存，备用。

2.2.2免疫磁珠抗体标记量的优化按照2.2.1节方法，分别按抗体/磁珠=0、20、30、40和50 μg/mg（w/w）的比例加入单抗11D8D4制备免疫磁珠（Immunomagnetic beads，IMBs）。分别取100 μg IMBs与1 mL猪霍乱沙门氏菌菌液（2.1×106 CFU/mL）混合，室温下混旋反应1 h，磁分离，取上清液，用平板计数法计算菌数，按公式（1）计算捕获率（Capture efficiency， CE）。所有数据均为3次实验的平均值。

2.3.3IMBs的特异性分析

1株猪霍乱沙门氏菌和13株非猪霍乱沙门氏菌被用于IMBs的特异性分析实验。分别取1 mL待检菌菌液（106 CFU/mL），加入100 μg IMBs，室温反应1 h，磁分离，计算CE。

2.4免疫荧光微球的制备与条件优化

2.4.1免疫荧光微球的制备取1 mL 磷酸盐缓冲液（PB， pH 6， 0.02 mol/L），加入50 μg 荧光微球，涡旋混匀后加入5 μL EDC溶液（1 mg/mL）。磁力搅拌下，缓慢加入11D8D4抗体，反应2 h， 11000 r/min离心20 min，取上清液，用BCA试剂盒测上清中的游离抗体含量，按公式（2）计算抗体偶联率（Conjugating ratio， CR）。沉淀以1 mL PB缓冲液重悬，加入100 μL 5%酪蛋白封闭1 h。11000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀用100 μL 重悬液（0.02 mol/L Na2HPO3，pH 7.4； 3%海藻糖； 1% 酪蛋白； 3%蔗糖； 0.1% 叠氮化钠； 1% Tween20）重悬， 4℃保存。

CR=c1-c2c1×100%（2）

式中， c1为加入抗体量， c2为上清液中游离抗体量。

2.4.2标记参数的优化在不同pH条件下制备免疫荧光微球（Immunofluorescent microspheres， IFMs），测量抗体偶联率，然后以制备的IFMs检测猪霍乱沙门氏菌（1.52×106和1.52×107 CFU/mL）； 分别按抗体/荧光微球=100， 200， 300， 400， 500和600 μg/mg（w/w）的比例加入单抗11D8D4制备IFMs，并测量抗体偶联率，然后以制备的IFMs检测猪霍乱沙门氏菌。

2.5FMLFA的优化与评价

2.5.1荧光微球免疫层析试纸条的组装NC膜上分别喷涂抗猪霍乱沙门氏菌单抗5F11B11和驴抗鼠IgG（1.0 mg/mL）作为检测线（T 线）和质控线（C线），30 ℃真空干燥4 h。将样本垫、结合垫、NC膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，组装成试纸条。

2.5.2T线抗体浓度的优化分别以0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mg/mL的5F11B11抗体喷涂T线，取100 μL 猪霍乱沙门氏菌（1.52 ×107，3.8 × 106和1.9 × 106 CFU/mL）与2 μL IFMs预反应5 min，然后用荧光微球免疫层析试纸条检测，10 min后用荧光读取仪测定T线信号值。

2.5.3FMLFA的特异性分析1株猪霍乱沙门氏菌和13株非猪霍乱沙门氏菌被用于试纸条的特异性实验。分别取100 μL待检菌菌液（1×107 CFU/mL）和2 μL免疫荧光微球预反应5 min，然后用荧光微球免疫层析试纸条检测，10 min后用荧光读取仪测定T线信号。

2.6基于IMS的FMLFA的建立与评价

2.6.1基于IMS的FMLFA的建立向1 mL 猪霍乱沙门氏菌菌液中加入100 μg免疫磁珠，室温下反应1 h，磁分离，弃上清液，沉淀以100 μL PBS重悬，90℃水浴10 min，洗脱磁珠上的目标菌[24]，磁分离后用FMLFA检测。

2.6.2FMLFA与基于IMS的FMLFA在不同基质中灵敏度的比较取PBS梯度稀释猪霍乱沙门氏菌（0， 7.6×104， 1.52×105， 7.6×105， 1.52×106， 3.8×106， 7.6×106和1.52×107 CFU/mL），分别按照2.5.3和2. 6.1节的方法进行检测。

取100 μL猪霍乱沙门氏菌加标的牛奶（终浓度为0， 7.6×104， 1.52×105， 7.6×105， 1.52×106， 3.8×106， 7.6×106， 1.52×107 ， 1.52×108和3.14×108 CFU/mL），按照2.5.3節的方法进行检测。取1 mL猪霍乱沙门氏菌加标的牛奶（终浓度为0， 7.6×104， 1.52×105， 7.6×105， 1.52×106， 3.8×106， 7.6×106和1.52×107 CFU/mL），按照2.6.1节的方法进行检测。

3结果与讨论

3.1IMBs抗体标记量及IMBs用量的优化

如图1A所示，随着标记抗体投入量的增加，IMBs对猪霍乱沙门氏菌的捕获率不断升高，当抗体投入量为30 μg/mg磁珠时，捕获率为93.75%，随抗体投入量不断增加，捕获率趋于稳定。这是由于磁珠表面羧基量是一定的，随着标记抗体量的增加，磁珠表面偶联的抗体量逐渐增加，并至趋于稳定，免疫磁珠对猪霍乱沙门氏菌的捕获率也趋于稳定。因此最优抗体投入量选择为抗体/磁珠=30 μg/mg（w/w）。

如图1B所示，随着IMBs用量的增加，IMBs对猪霍乱沙门氏菌的捕获率逐渐增大，当IMBs的用量为100 μg/mL时，捕获率达到90%，增加IMBs的用量到200 μg/mL时，捕获率没有明显增加。因此，最优IMBs用量选择为100 μg/mL。

3.2对不同浓度的猪霍乱沙门氏菌的捕获效率

如图1C所示，制备的IMBs对2.1×102， 2.1×103， 2.1×104， 2.1×105和2.1×106 CFU/mL的猪霍乱沙门氏菌捕获率均达到90%以上，说明制备的IMBs可对浓度102～106 CFU/mL的猪霍乱沙门氏菌进行有效富集。

3.3IMBs特异性实验的结果

IMBs对1×107 CFU/mL猪霍乱沙门氏菌的捕获率可达93%，对1×107 CFU/mL 的13株非猪霍乱沙门氏菌的捕获率小于5%，表明IMBs捕获特异性较好。

3.4IFMs標记条件的优化

3.4.1IFMs标记pH值的优化pH值对荧光微球的标记影响很大，会影响抗体表面可供偶联的活性基团的数量和其暴露程度，从而影响偶联率，也可能影响抗体和荧光微球的结合方式，从而影响IFMs的活性[25]。如表1所示，当pH=6时，偶联率最高。检测1.52×107 CFU/mL的目标菌时，T线的信号值最大。检测1.9×106 CFU/mL目标菌时，只有pH=6的条件对应试纸条T线出现信号。因此，最佳标记条件选择pH 6。

AbstractImmunomagnetic separation （IMS） was coupled with fluorescent microspheres lateral flow assay （FMLFA） for rapid detection of S. choleraesuis in this study. The target bacteria were firstly enriched from sample by immunomagnetic beads （IMBs）， then eluted by heat treatment and detected by fluorescent microspheres lateral flow test strip. The IMBs was labeled with 30 μg/mg antibody， and the capture efficiency was greater than 90% against 102-106 CFU/mL of S. choleraesuis with great specificity. The immunofluorescent microspheres were prepared by coupling 300 μg of 11D8D4 monoclonal antibody with 1 mg of fluorescent microspheres at pH 6. Monoclonal antibody 5F11B11 （2.0 mg/mL） and donkey antimouse IgG （1.0 mg/mL） were sprayed on nitrocellulose membrane as test line and control line， respectively. The FMLFA based on IMS was used to detect S. choleraesuis in PBS and milk. The limits of detection in PBS buffer and milk were 1.5×105 CFU/mL and 7.6×105 CFU/mL respectively， which were 10 and 200 times lower than that of traditional fluorescent microspheres lateral flow assay， respectively. The results showed that the method， which could enrich S. choleraesuis in milk effectively， could avoid matrix interference and improve the detection sensitivity， thus had a good application prospect.

KeywordsImmunomagnetic separation； Fluorescent microspheres； Lateral flow assay； S. choleraesuis