caveolin—1脚手架样结构域多肽对HEp2细胞迁移和侵袭能力的影响

顾栋桦　付琳琳　平金良

[摘要] 目的 研究caveolin-1脚手架样结构域（caveolin-scaffolding domain，CSD）多肽对HEp2细胞迁移和侵袭能力的影响，并探讨其分子机制。 方法 CSD多肽和乱序多肽由人工合成得到，并在N'末端用生物素标记。用免疫细胞化学法检测CSD多肽在HEp2细胞中的渗透情况，划痕实验检测细胞的迁移能力，Transwell细胞体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力；免疫印迹法检测HEp2细胞中FAK蛋白的表达水平及磷酸化程度。 结果 免疫细胞化学检测显示CSD多肽能够较好地进入HEp2细胞内；CSD多肽组HEp2细胞迁移能力明显低于乱序组和空白对照组（P均<0.01），而乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）；CSD多肽组发生侵袭的细胞数明显低于乱序组和空白对照组（P均<0.01），而乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）；免疫印迹法检测结果显示，CSD多肽组FAK相对磷酸化程度明显低于乱序组与空白对照组（P均<0.01）。 结论 caveolin-1脚手架样结构域多肽可顺利进入HEp2细胞内，而且可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，FAK磷酸化水平的下调可能是其中重要的分子机制。

[关键词] Caveolin-1；粘着斑激酶；多肽；鳞状细胞癌；肿瘤浸润

[中图分类号] R73-3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）30-0029-04

Caveolin-1是人体细胞膜上重要的膜蛋白，它能够和许多信号转导相关蛋白结合，影响下游信号通路活性，从而调节细胞的生物学行为。在部分肿瘤的研究中，Caveolin-1基因的过表达可以抑制肿瘤细胞的生长。Caveolin-1蛋白结构中存在一个脚手架样的区域（caveolin-scaffolding domain， CSD），CSD是caveolin-1参与调节细胞膜蛋白生物学活性的重要区域，在细胞生命活动中发挥重要作用[1]。肽类药物因其具有特异性的靶向作用，正逐渐成为肿瘤治疗研究的热点[2]。本研究通过人工合成CSD多肽，观察其作用于喉鳞状细胞癌HEp2细胞株后，对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1细胞及培养条件

人喉鳞状细胞癌HEp2细胞株购于美国ATCC公司，用含10%胎牛血清（hyclone公司，美国）的DMEM培养基培养，培养条件：37℃、5%CO2、饱和湿度。

1.2 CSD多肽的氨基酸序列与合成

CSD多肽氨基酸序列为DGI WKA SFT TFT VTK YWF YR，以同样的氨基酸种类和数量随机排列，并合成得到的乱序多肽做为阴性对照。多肽序列均由上海翱博生物科技有限公司合成，肽链N端连接生物素标记，多肽作用于细胞的终浓度为4.0 μM。

1.3 免疫细胞化学法检测多肽的细胞渗透效能

HEp2细胞贴壁生长至细胞密度为70%时，加入CSD多肽孵育6 h后，弃去培养液，加入冷丙酮固定10，然后滴加碱性磷酸酶（AP）标记的抗生物素抗体（工作浓度1：300；Jackson Immuno Research公司，美国），在湿盒内37 ℃孵育2 h，用PBS冲洗后加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝（NBT/BCIP；Roche公司，瑞士）显色。

1.4 细胞划痕实验

取2×105 HEp2细胞接种于六孔培养板中，当细胞生长至100%汇合时，换无血清培养液，实验组中加入CSD多肽，乱序多肽做为阴性对照组，无血清培养液为空白对照组。用移液器管嘴在细胞层轻轻划出约1 mm宽的划痕后继续培养，在0、24 h、48 h时镜下用Zeiss LSM Image Browser 3.1 软件（Mississauge公司，加拿大）测量划痕的宽度变化，细胞迁移率=（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。实验均重复3次。

1.5 Transwell细胞体外侵袭实验

实验使用Biocoat Matrigel Invasion Chamber试剂盒（BD公司，美国），根据试剂盒说明书操作，步骤简述如下：获得约5×103 HEp2细胞，接种于上层小室中，加入无血清培养液至300 mL，实验组中加入CSD多肽，乱序多肽做为阴性对照组，无血清培养液为空白对照组，37 ℃培养24 h后，用棉签把表层的细胞抹去，加入4%多聚甲醛固定30 min，800 μL Giemsa染液染色20 min，取出膜片至顯微镜下观察，随机选取10个400倍视野计数细胞。实验均重复3次。

1.6 免疫印迹法

细胞分为三组，实验组中加入CSD多肽，乱序多肽做为阴性对照组，无血清培养液为空白对照组，细胞培养24 h后，HEp2细胞用含有磷酸化酶抑制剂的蛋白裂解液处理，得到细胞总蛋白，蛋白用BCA法测定浓度，取60 μg蛋白行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭后加入一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗后加入HRP标记的二抗（工作浓度1：2000，Santa Cruz公司，美国），目的蛋白条带的显示使用ECL试剂盒（pierce公司，美国），按照说明书步骤操作曝光显影，目的条带用Pro analyzer 4.0软件进行分析。一抗：小鼠抗人Phospho-FAK（Tyr397）及FAK单克隆抗体（Bioscience公司，美国），工作浓度1∶1000；小鼠抗人β-actin单克隆抗体（Sigma公司，美国），工作浓度1∶1000。实验均重复3次。

1.7 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSD多肽能够渗透进入HEp2细胞内

免疫细胞学检测结果显示，在CSD多肽处理的HEp2细胞中，经NBT/BCIP显色，显微镜下可看到HEp2细胞胞质中显现出蓝紫色颗粒（图1），说明CSD多肽能够透过细胞膜有效渗入到细胞内部。

2.2 CSD多肽对HEp2细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示，CSD多肽组、乱序肽组和空白对照组的48 h细胞迁移率分别为（15.11±3.09）%、（66.45±5.24）%和（68.13±5.73）%，三组差异有统计学意义（F=116.77，P<0.01）；CSD多肽组细胞迁移能力明显低于乱序肽组和空白对照组（P均<0.01），而乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.3 CSD多肽对HEp2细胞侵袭能力的影响

细胞体外侵袭能力检测结果显示，CSD多肽组、乱序肽组及空白对照组每高倍视野侵袭的细胞数分别为（131.38±43.42）、（373.51±56.24）和（384.39±53.68），三组差异有统计学意义（F=23.14，P<0.01）；CSD多肽组细胞侵袭能力明显低于乱序肽组和空白对照组（P均<0.01），而乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.4 CSD多肽对HEp2细胞FAK磷酸化的影响

免疫印迹法检测结果显示，CSD多肽组、乱序肽组与空白对照组的FAK相对磷酸化程度（磷酸化FAK蛋白量/总FAK蛋白量）分别为（0.23±0.02）、（0.43±0.04）、（0.45±0.03），三组比较差异有统计学意义（F=44.20，P<0.01），CSD多肽组明显低于空白对照组与乱序肽组（P均<0.01），乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。CSD多肽组、乱序肽组、空白对照组的总FAK蛋白表达量组间比较差异无统计学意义（F=0.052，P>0.05）。见图4。

3 讨论

人体细胞的细胞膜上存在一个小凹样结构，称为caveolea，caveolea在细胞生命活动中非常重要。Caveolin-1是caveolae的主要功能蛋白，大小为21～24 kD，caveolin-1蛋白由178个氨基酸构成，其N端第82～101氨基酸残基是其重要功能区域，具有一个脚手架样结构（caveolin-scaffolding domain，CSD），这个CSD结构可以和许多信号转导相关蛋白结合，并调节其下游信号转导通路的活性，最终影响细胞的生物学行为[1]。

研究发现许多肿瘤细胞株的caveolin-1表达处于低水平状态，增加caveolin-1的表达可以抑制肿瘤细胞的生长和转移、促进肿瘤的凋亡[3，4]。一些肿瘤的临床病理学研究发现，在乳腺癌[5]、肝细胞性肝癌[6]、结肠腺癌[7]的癌细胞中caveolin-1的表达水平越低，肿瘤患者的预后越差。因此许多学者认为caveolin-1基因可能是一个抑癌基因。但是，有其他一些研究却得出了相反的结果，发现caveolin-1的高表达与肿瘤的恶性生物学行为相关[8]， 例如， 在肺大细胞癌中，caveolin-1表达越高，病人的预后越差[9]，增加caveolin-1基因的表达可以促进子宫内膜癌[10]和胰腺癌细胞株[11]生长和转移能力。因此，caveolin-1很可能在不同的条件下发挥不同的生物学功能。

Ortiz等[12]在黑色素瘤的研究中发现caveolin-1蛋白第14位酪氨酸残基的磷酸化能够增强肿瘤细胞的侵袭转移能力，而不能发生磷酸化的突变caveolin-1基因（Y14F-CAV1基因）却不具有这样的促进功能。许多研究表明前列腺癌中caveolin-1基因处于高表达的状态，而且caveolin-1的高表达与肿瘤的恶性程度正相关[13，14]，而用caveolin-1脚手架结构域氨基酸序列人工合成多肽（CSD肽），并且用CSD多肽作用于前列腺癌细胞，却能够抑制肿瘤细胞的生长，并且减少肿瘤组织内新生血管的生成[15]。因此，有理由推测，caveolin-1蛋白的CSD区域是其发挥抑制肿瘤效应的关键部位，当其N端氨基酸残基磷酸化后，caveolin-1蛋白可能由于分子构象的改变而使CSD的功能受到了抑制。如果能够使CSD结构处于持续的活性状态，很可能就可以充分发挥CAV1的抗肿瘤的功能。

喉鳞状细胞癌是头颈部肿瘤中的常见类型，研究表明，caveolin-1基因的过表达可以抑制喉鳞癌细胞株HEp2细胞的生长能力[16]，而且低表达caveolin-1基因的头颈部鳞癌更容易发生上皮-间质转化和淋巴结转移[17]，表明caveolin-1在喉鳞癌中可能具有抑制肿瘤的作用。本研究中，我们人工体外合成得到了CSD多肽，并且作用于HEp2细胞，实验结果显示CSD多肽能够顺利进入HEp2细胞内，说明CSD多肽具有较好的渗透性。用CSD多肽处理HEp2细胞后，肿瘤细胞的细胞迁移能力下降了77.82%，侵袭能力下降了65.82%，均被明显抑制，而乱序肽并无明显抑制效果，表明用外源性的CSD多肽在体外能够抑制HEp2细胞的侵袭转移能力，具有一定的潜在临床应用前景。

CSD多肽能够与细胞内的许多生物活性蛋白结合，并影响相关的信号通路活性。肿瘤细胞的侵袭和转移是一个多因素参与的复杂过程，许多信号转导通路在其中发挥重要的作用。粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是蛋白酪氨酸激酶超家族中的一员，很多肿瘤中FAK的表达升高，目前的研究表明其表达与肿瘤的转移情况密切相关，FAK能够发生磷酸化并被激活，從而通过激活相关的信号通路促进肿瘤细胞的侵袭和转移能力[18，19]。因此，我们检测了HEp2细胞中FAK磷酸化水平，发现用CSD多肽处理HEp2细胞后，FAK相对磷酸化水平下降了48.89%。在一项黑色素瘤的研究中，研究者发现caveolin-1能够通过下调黑色素瘤B16F10 细胞株FAK的磷酸化水平， 抑制肿瘤细胞的转移能力[20]。FAK磷酸化水平的下降可能是CSD多肽抑制HEp2细胞侵袭转移能力的重要机制，但CSD多肽通过何种分子机制影响FAK的磷酸化水平还需要深入研究。

綜上所述，本研究体外细胞学实验结果提示CSD多肽能够顺利进入HEp2细胞内，并能够抑制HEp2细胞的迁移和侵袭能力，FAK磷酸化水平的下调可能是其中重要的分子机制，CSD多肽的抑制肿瘤的功能及具体的分子机制还有待进一步探讨。

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（收稿日期：2016-08-05）