猪O型口蹄疫病毒细菌样颗粒疫苗的制备与免疫原性鉴定

侯立婷，陈瑾，乔绪稳，于晓明，侯继波,3，郑其升，李槿年

1 安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036

2 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014

3 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009

猪O型口蹄疫病毒细菌样颗粒疫苗的制备与免疫原性鉴定

侯立婷1,2，陈瑾2，乔绪稳2，于晓明2，侯继波2,3，郑其升2，李槿年1

1 安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036

2 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014

3 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009

侯立婷, 陈瑾, 乔绪稳, 等. 猪O型口蹄疫病毒细菌样颗粒疫苗的制备与免疫原性鉴定. 生物工程学报, 2017, 33(2): 217–227.

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验证基于革兰氏阳性增强基质 (Gram-positive enhancer matrix，GEM) 展示口蹄疫病毒细菌样颗粒(Bacteria-like particles，BLP) 疫苗的可行性。按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成基于猪口蹄疫病毒Mya98株序列的3种抗原基因设计，并将其插入到含有锚钩蛋白基因的原核表达载体pQZ-PA，鉴定阳性后转入Escherichia coliBL21，进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因表达及产物的可溶性进行分析。利用GEM颗粒纯化目的蛋白，制备细菌样颗粒疫苗抗原；利用BCA试剂盒测定重组蛋白的浓度，将重组蛋白与白油佐剂乳化，制备疫苗，免疫5周龄小鼠，同时设商品化多肽苗对照与空白对照，免疫后不同时间采集试验小鼠血清，利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗体检测试剂盒和O型口蹄疫抗体液相阻断酶联免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 检测试剂盒检测免疫小鼠血清的抗体水平；利用噻唑蓝比色法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT) 测定淋巴细胞增殖情况；利用荧光定量PCR方法检测相关细胞因子表达，评价细胞免疫水平。SDS-PAGE结果表明，设计在大肠杆菌中的3种口蹄疫病毒抗原基因均以可溶形式获得高效表达；Western blotting结果显示，表达的重组蛋白能够与口蹄疫病毒阳性血清发生反应，利用GEM颗粒能够实现重组蛋白的一步离心纯化，制备BLP疫苗抗原；免疫试验结果表明，设计的重组抗原B (T1BT2) 4B不但能够刺激免疫小鼠产生更高水平的多肽特异性ELISA抗体与口蹄疫特异性液相阻断抗体，而且产生了更高水平的脾淋巴细胞增殖及Th1型的细胞因子分泌。初步实验结果表明，本研究制备的BLP疫苗GEM-B (T1BT2) 4B具有良好的免疫原性，为研究口蹄疫病毒基因工程亚单位疫苗开辟了一条新的思路。

口蹄疫病毒，VP1蛋白，可溶性表达，细菌样颗粒疫苗，免疫原性

口蹄疫 (Foot-and-mouth disease，FMD) 是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，FMDV) 引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。临床特征是在偶蹄动物口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病毒传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大的经济损失，世界动物卫生组织 (OIE) 将其列为法定报告的动物传染病之一[1–3]。在我国，FMD属于国家强制免疫类疾病，目前商品化的疫苗有FMD灭活疫苗和多肽疫苗两种。目前FMD O型合成肽疫苗由于具有安全性好、免疫原性强和免疫副反应小等优点而得到广泛的应用[4–5]。Brown等用大肠杆菌表达的FMDV VP1基因第140–160和200–213位肽段串联多肽免疫牛、猪等动物，结果显示可获得较好的免疫力[6]。Chan将FMDV VP1基因编码的第141–160位肽段和200–213位肽段串联起来与猪IgG重链进行融合表达，所得产物免疫后猪可以抵抗50LD50的FMDV攻击[7]。王长怡将O型FMDV VP1蛋白141–160位肽段和一个具有广谱性的辅助性T细胞表位进行化学合成，制备疫苗免疫猪后可以抵抗104.5TCID50FMDV的强毒攻击[8]。方明丽等利用O型FMDV VP1上的主要表位，模拟天然口蹄疫病毒的VP1蛋白构象，将其进行不同数量、不同形式的串联表达，免疫豚鼠和牛后能产生了较高滴度的中和抗体[9]。

革兰氏阳性增强基质表面展示系统 (Grampositive bacteria enhancer matrix particles，GEM)是近几年发展起来的一种颗粒抗原制备新技术。该系统包括GEM颗粒和蛋白锚钩 (Protein anchor，PA) 两个构件。GEM颗粒是乳酸乳球菌MG1363经热酸煮沸处理，去除全部蛋白和核酸等物质后获得的球形肽聚糖骨架[10]。蛋白锚钩PA是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的一个结构域，可以非共价方式特异性与肽聚糖结合。大量研究表明，与PA融合表达的目标蛋白能够展示在GEM颗粒表面，以GEM为骨架形成颗粒样抗原。该系统操作简单，只需一步离心即可完成颗粒抗原的制备[11–13]。

目前，关于FMD亚单位疫苗的研究存在以下问题：1) 靶标抗原在E. coli中表达时，多数以包涵体形式存在，需要变性复性过程，在大规模生产中难以实现；2) 大多数研究中对表达蛋白的纯化是利用Ni-NTA树脂纯化，这种方法成本高，操作繁琐，在大生产中也难以实现[14]；3) 与E. coli表达系统表达相比，人工合成肽疫苗仍然存在成本过高的缺点。如果能够对FMDV的抗原表位加以组合、设计，在选择合适的大肠杆菌表达系统的基础上，实现重组抗原在E. coli中的可溶性表达，结合GEM技术实现抗原的快速纯化与表面展示，对于FMDV基因工程亚单位疫苗研究具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

含有锚钩蛋白基因的重组原核表达载体pQZ-PA由本课题组保存[15]。质粒提取、胶回收试剂盒购自AxyGEN公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PCR试剂、pMD19-T vector、DNA Marker等试剂购自宝生物工程 (大连) 有限公司；DH5α、BL21感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白质分子量Marker、BCA试剂盒为Thermo Fisher Scientific公司产品；PVDF膜为Millipore公司产品；FMDV多肽阳性血清由本实验室制备，系用商品化的申联生物医药 (上海) 股份有限公司生产的FMDV合成肽疫苗多次免疫小鼠获得；DAB显色液、HRP标记的羊抗鼠IgG、MTT购自南京生兴生物科技有限公司；5周龄的ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心；FMDV多肽ELISA抗体检测试剂盒购自上海优耐特生物医药有限公司；O型口蹄疫液相阻断抗体ELISA检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；其余化学试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 抗原表位设计与合成

主要靶抗原表位包括FMDV Mya 98株VP1蛋白上的主要B细胞表位 (B：第140–160位，20个氨基酸) 与两个辅助性T细胞表位Th1[VP1 (第200–213位，14个氨基酸)]、Th2 [3A (第21–35位，15个氨基酸)]。共设计了3种抗原，表位之间均有接头连接：1) BT1B：编码FMDV VP1两个拷贝的141–160位氨基酸残基和一个拷贝的200–213位氨基酸残基构成的串联片段20 AA–14 AA–20 AA的核苷酸片段；2) BT2B：编码FMDV VP1两个拷贝的141–160位氨基酸残基和一个拷贝的21–35位氨基酸残基构成的串联片段20 AA–15 AA–20 AA的核苷酸片段；3) B (T1BT2) 4B：编码FMDV VP1两个拷贝的141–160位氨基酸残基和一个拷贝的200–213位氨基酸残基及和一个拷贝的21–35位氨基酸残基构成的串联片段20 AA–(14 AA–20 AA–15 AA) 4–20 AA的核苷酸片段。所有基因均按照大肠杆菌表达优化合成，在序列两端添加BamHⅠ和Hind Ⅲ两个酶切位点，并克隆入pUC57载体。

1.3 重组质粒的构建

将基因片段BT1B、BT2B与B (T1BT2) 4B从pUC57载体上通过BamHⅠ和Hind Ⅲ两个酶切位点切下，克隆到含有锚钩蛋白基因的原核表达载体pQZ-PA，构建重组表达质粒，分别将其命名为pQZ-BT1B-PA、pQZ-BT2B-PA和pQZ-B (T1BT2) 4B-PA。

1.4 重组菌的构建与诱导表达

1.4.1 重组表达菌的获得

将重组质粒pQZ-BT1B-PA、pQZ-BT2B-PA、pQZ-B (T1BT2) 4B-PA分别转化大肠杆菌BL21，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落，得到重组菌pQZ-BT1B-PA/BL21、pQZ-BT2B-PA/BL21及pQZ-B (T1BT2) 4B-PA/BL21。将空质粒pQZ按照相同的方法转化感受态大肠杆菌BL21，得到对照菌株pQZ/BL21。

1.4.2 重组菌的诱导表达

挑取重组菌pQZ-BT1B-PA/BL21、pQZ-BT2B-PA/BL21、pQZ-B (T1BT2) 4B-PA/BL21与pQZ/BL21单菌落，接种5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，作为种子液。次日将种子液按1∶100比例转接含氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃、220 r/min振荡培养1.5–2 h (OD600达到0.5–1.0)，加入终浓度为0.4 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷，15 ℃诱导24 h，收获细菌。

1.5 目的蛋白的可溶性鉴定

取2 mL诱导后菌液，离心收集菌体，用1 mL PBS缓冲液重悬，在冰水浴中超声波破碎细胞。破碎后离心转移全部上清，保留备用，沉淀用1 mL PBS缓冲液重悬。将完整的诱导菌体以及超声波破碎后的上清、沉淀进行SDS-PAGE电泳，检测融合蛋白的表达及可溶性。

1.6 Western blotting鉴定

重组蛋白SDS-PAGE电泳后再转印到PVDF膜上，5%的BSA 37 ℃封闭孵育1 h，TBST洗涤2次，加1∶100稀释的小鼠阳性血清孵育过夜，TBST洗涤5次，5 min/次，加1∶5 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST洗涤5次，5 min/次，DAB显色后观察特异性条带。

1.7 BLP疫苗抗原的制备

从–70 ℃取出制备好的GEM颗粒，1 U的GEM颗粒离心后用适量蛋白重悬，室温缓慢转动孵育30 min，离心收集沉淀，用SDS-PAGE及电镜观察鉴定效果。

1.8 BLP疫苗免疫原性鉴定

1.8.1 蛋白定量及小鼠免疫

分别取3个重组蛋白破碎后上清1 mL，与GEM颗粒结合后离心取沉淀，重悬于1 mL PBS中，加入50 μL 10% SDS，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，分离沉淀和上清，取上清用BCA试剂盒测蛋白浓度。按照50 μg/只的剂量与白油乳化制备BLP疫苗，免疫5周龄的ICR小鼠，每组8只，同时设置空菌、空白和多肽疫苗 (生产厂家：申联生物医药 (上海) 股份有限公司，批号：(2014) 090297522) 对照组。皮下多点注射200 μL/只，免疫21 d后加强免疫200 μL/只，分别于免后21、35、49和63 d采集血液进行间接ELISA与LPB-ELISA抗体检测。

1.8.2 间接ELISA抗体检测

取出试剂盒中的样品稀释板，每孔加入200 μL样品稀释液，在相应孔加入10 μL对照血清或被检血清，振荡。对照血清设两个平行，其余各1个孔。取出抗原包被板，分别从稀释板上取稀释好的对照和被检血清各100 μL，封膜后37 ℃作用1 h。洗涤液洗板5次，加HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃作用30 min，洗板5次，TMB显色15 min，加终止液，酶标仪测定450 nm波长下的OD值。

1.8.3 液相阻断抗体检测

血清抗体检测根据O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒说明书，血清用PBST进行两倍比稀释，稀释度从1∶2–1∶64，然后与等体积的病毒抗原混合，37 ℃作用1 h。取出预先用兔抗口蹄疫特异性抗体包被的96孔板，将作用好的抗原抗体混合液转移到该板，37 ℃作用1 h后，用PBST洗板5次，加豚鼠抗口蹄疫血清，37℃作用30 min，PBST洗板5次，加HRP标记的抗豚鼠血清，37 ℃作用30 min，PBST洗板5次，OPD显色15 min，加终止液，酶标仪测定492 nm波长下的OD值。抗原对照4孔，弃去最高和最低OD492，计算剩余2孔的平均OD492值再除以2，即50%对照值，该值即为临界值。被检血清OD492值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD492值相同，则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价。

1.8.4 小鼠淋巴细胞增殖试验

无菌采取小鼠脾脏，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以含10% (V/V) 新生牛血清的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度约为2×107个/mL，加入96孔细胞板内，100 μL/孔，每个样品做3个重复，向各孔内加入5 μg人工合成的猪O型FMDV GH loop表位多肽 (VP1 140–160位AA)作为刺激抗原，同时设PHA作为阳性对照组，每孔加入2 μg的PHA，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养60 h，再每孔加入5 μg/mL MTT 10 μL，继续培养4 h。测定OD492值，取3个平均值计算刺激指数 (SI)，试验设不加口蹄疫抗原的营养液对照。以刺激指数 (SI) 作为判断淋巴细胞转化程度的参数，(SI=刺激孔OD492值/培养液对照孔OD492值)。

1.8.5 小鼠细胞因子检测

采取相同质量的免疫小鼠脾脏研磨，反复冻融3次，用Trizol裂解法提取RNA，利用一步反转试剂盒获得cDNA。根据GenBank中公布的相关序列设计引物，参考文献[16]的方法利用荧光定量PCR检测IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α的基因水平。

2 结果与分析

2.1 目的基因的质粒鉴定

将合成的目的基因用BamHⅠ与Hind Ⅲ酶切回收后，克隆到重组原核表达载体pQZ-PA上，获得重组质粒pQZ-BT1B-PA、pQZ-BT2B-PA和pQZ-B (T1BT2) 4B-PA，然后进行酶切鉴定。酶切的产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测可得到200、400和700 bp左右的目的片段 (图略)，与预期设计的目的基因片段大小一致。

2.2 重组蛋白的表达及可溶性分析

将鉴定正确的重组表达质粒转化BL21感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个菌落培养。取菌液接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养到细菌浓度达到OD600为0.5−1时加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，诱导24 h后，菌液离心去除培养基，用PBS重悬菌体后经高压破碎仪破碎菌体，用SDS-PAGE检测表达产物 (图1)，3个融合蛋白都可以表达，分子量大小分别约为47、28与36 kDa，并且3个蛋白均能以可溶性形式存在于菌体破碎的上清中。

图1 重组蛋白表达及可溶性分析结果Fig. 1 Expression and solubility identification of the recombinant protein with SDS-PAGE. M: protein molecular marker; 1: blank control of BL21 transformed with plasmid pQZ; 2: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-B (T1BT2) 4B-PA; 3: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-B (T1BT2) 4B-PA transformed BL21; 4: sediment for recombinant plasmid pQZ-B (T1BT2) 4B-PA transformed BL21 after supersonic; 5: blank control of BL21 transformed with plasmid pQZ; 6: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-BT1B-PA; 7: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT1B-PA transformed BL21; 8: sediment for recombinant plasmid pQZ-BT1B-PA transformed BL21 after supersonic; 9: blank control of BL21 transformed with plasmid pQZ; 10: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-BT2B-PA; 11: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT2B-PA transformed BL21; 12: sediment for recombinant plasmid pQZ-BT2B-PA transformed BL21 after supersonication.

2.3 重组蛋白表达产物的Western blotting鉴定

经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，用小鼠抗O型FMDV多肽阳性血清对表达产物进行Western blotting鉴定，结果如图2所示，在PVDF膜上获得的条带与SDS-PAGE表达的蛋白条带大小一致，这表明表达的重组蛋白可被特异性的抗体所识别，具有较好的抗原性。

2.4 GEM纯化目的蛋白的SDS-PAGE鉴定

如图3所示，利用SDS-PAGE可检测到较高纯度目的蛋白的存在，纯化后pQZ-BT1B-PA重组蛋白浓度为85 μg/mL；纯化后pQZ-BT2B-PA重组蛋白浓度为213 μg/mL；纯化后pQZ-B (T1BT2) 4B-PA重组蛋白浓度为870 μg/mL；利用透射电镜观察可见，与未结合之前的GEM相比，结合重组蛋白后的GEM颗粒有很多不规则的细小成团结合物，可能是蛋白形成了多聚体 (图4)。

图2 重组蛋白的Western blotting鉴定结果Fig. 2 Western blotting analysis of recombinant protein. M: protein molecular marker; 1: blank control of BL21 transformed with plasmid pQZ; 2: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-BT1B-PA; 3: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT1B-PA transformed BL21; 4: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-BT2B-PA; 5: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT2B-PA transformed BL21; 6: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-B (T1BT2) 4B-PA; 7: supernatant of supersonicated recombinant plasmid pQZ-B (T1BT2) 4B-PA transformed BL21.

图3 重组蛋白纯化鉴定结果Fig. 3 Purification analysis of recombinant protein. M: protein molecular marker; 1: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT1B-PA transformed BL21; 2: supernatant for BT1B-PA treated with GEM particles; 3: sedimentation for BT1B-PA treated with GEM particles; 4: GEM particles; 5: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT2B-PA transformed BL21; 6: supernatant for BT2B-PA treated with GEM particles; 7: sedimentation for BT12B-PA treated with GEM particles; 8: GEM particles; 9: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-(BT1BT2) 4B-PA transformed BL21; 10: supernatant for B (T1BT2) 4B-PA treated with GEM particles; 11: sedimentation for B(T1BT2)4B-PA treated with GEM particles; 12: GEM particles.

图4 BLP抗原透射电镜观察结果Fig. 4 Transmission electron microscopic images of BLP antigen. (A) Recombinant protein BT1B treated with GEM particles. (B) Recombinant protein BT2B treated with GEM particles. (C) Recombinant protein B (T1BT2) 4B treated with GEM particles. (D) Blank GEM particles. controls.

2.5 免疫小鼠抗体检测结果

2.5.1 多肽间接ELISA检测结果

小鼠血清按试剂盒操作规程做1∶20倍稀释，测得其临界值为0.495，大于临界值判为抗体阳性。结果如图5所示，表达的B (T1BT2) 4B重组蛋白免疫后35 d后即可产生较高的抗体水平，与多肽苗类似。而BT1B重组蛋白和BT2B重组蛋白免疫后小鼠体内抗体水平一直较低。

2.5.2 液相阻断抗体水平检测结果

如图6所示，B (T1BT2) 4B重组蛋白组小鼠免疫后液相阻断抗体水平均高于BT1B和BT2B重组蛋白免疫组，并且B (T1BT2) 4B重组蛋白组与多肽疫苗组相比，抗体衰减速度较慢。

2.5.3 淋巴细胞增殖实验结果

为了探讨BLP疫苗免疫小鼠针对FMDV GH loop抗原表位的淋巴细胞活化情况，对免疫后35 d的小鼠进行无菌分离脾脏，提取淋巴细胞，用MTT法检测淋巴细胞增殖情况。如图7所示，利用人工合成的FMDV多肽作为刺激原，B (T1BT2) 4B免疫组小鼠表现较强的特异性淋巴细胞增殖，免疫后35 d淋巴细胞增殖指数达到 (2.29±0.09)，统计学分析结果显示，与商品化的人工合成肽疫苗所引发的T细胞增殖反应差异不明显 (P＞0.05)，与设计的其他两种抗原免疫小鼠差异极显著 (P＜0.01)。

图5 疫苗免疫后多肽特异性抗体水平检测抗体检测结果Fig. 5 Detection of peptide-specific antibody in mice following vaccination with BLP vaccine by ELISA.

图6 疫苗免疫后液相阻断抗体水平检测抗体检测结果Fig. 6 Detection of antibody in mice following vaccination with BLP by LPB ELISA.

图7 疫苗免疫小鼠淋巴细胞增殖检测结果Fig. 7 Peptide specific T-cell proliferation responses in the mice after BLP vaccine immunization.

2.5.4 小鼠细胞因子检测结果

为了进一步研究BLP疫苗在免疫小鼠体内诱发特异性针对FMDV GH loop抗原表位的细胞免疫反应，对免疫后35 d的小鼠进行分离脾脏，提取RNA，用荧光定量PCR方法检测IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF的表达水平。由图8可知，利用人工合成的FMDV多肽作为刺激原，B (T1BT2) 4B免疫组小鼠IFN-γ与IL-4的水平与其他两种抗原设计差异极为显著 (P＜0.01)，与商品多肽疫苗免疫组差异不显著 (P＞0.05)，同时所有实验组IL-10、TNF水平变化均不显著，说明重组蛋白B (T1BT2) 4B免疫后诱导小鼠产生了明显的Th1型免疫反应，而没有诱导抑制性T细胞的产生。

图8 免疫小鼠相关细胞因子的检测结果Fig. 8 Detection of cytokine for immunized mice at 35 days post vaccination.

3 讨论

口蹄疫被列为我国必报传染病，国家采取强制免疫手段预防口蹄疫疫情。目前市场上商品化的疫苗主要是合成肽疫苗和灭活疫苗，均具有良好的免疫效果，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但由于全病毒灭活疫苗存在一定的毒力返强、病毒灭活不彻底、病毒逃逸等不安全因素，从而促使人们寻求一种更加安全高效的FMD疫苗[17–18]。

FMDV VP1结构蛋白暴露在病毒粒子表面，含有可诱导感染动物产生中和抗体的主要抗原表位，是FMD新型疫苗研究最多的结构蛋白[19-20]。研究发现，O型FMDV的5个抗原位点中有3个位于VP1结构蛋白上，其中第141–160位氨基酸为主要的B细胞表位，能够诱导机体产生体液免疫应答[21–22]。基于上述研究，本研究利用基因工程方法对O型FMDV中的抗原表位进行优化，将FMDV VP1结构蛋白上的B表位与病毒自身的辅助性T表位进行串联、重复表达，得到的3个重组蛋白经Western blotting鉴定可被特异性的抗体所识别，具有较好的抗原性。本研究选择50 μg/只的免疫剂量是出于以下考虑：1) 参考我们前期进行相关合成肽疫苗的动物实验的结果 (数据未发表)；2) 参考已发表关于小鼠免疫实验的资料，若免疫剂量过高，可能会引发免疫耐受，对正常的免疫应答造成负面影响；免疫剂量过低，由于没有足够的抗原量作保证，不能有效刺激机体产生坚实的免疫力[23–24]；3)同时考虑本次实验最主要的目的是鉴定我们不同表位疫苗设计免疫原性的差异，所以选择了一个相对较高的剂量。当然，本实验关于剂量选择是在实验动物上得出的一个初步结论，后期需要在本动物上进行重新筛选、验证。

小鼠免疫试验结果显示，B (T1BT2) 4B重组蛋白组小鼠可以产生较高水平的口蹄疫特异性抗体及液相阻断抗体，与目前市场上的商品化多肽苗的免疫效果类似，然而商品化多肽疫苗大多用化学合成的方法来制备多肽，成本较高。本研究利用大肠杆菌表达系统和GEM纯化系统生产制备的抗原可溶性高、成本低、制备过程简单方便。并且该蛋白免疫小鼠后能够有效刺激小鼠机体淋巴细胞的增殖，能够正向调节IL-4、IFN-γ的表达水平。

目前的研究资料已证实高水平的细胞免疫应答在抵抗FMDV感染和清除病毒过程中具有重要作用。B (T1BT2) 4B重组蛋白能够诱导高水平的体液和细胞免疫反应可能与几个因素有关：第一，细胞表位的数量多、串联方式能够有效地突出抗原表位，从而提高了重组蛋白的免疫原性[25]；第二，GEM颗粒的主要成分是肽聚糖本身为TLR2的激动剂，能够激活机体的天然免疫系统，具有免疫增强功能，提高了疫苗的免疫效力[26]。

本研究利用大肠菌表达系统获得GEM-B (T1BT2) 4B颗粒性疫苗能够诱导小鼠产生较高的体液和细胞免疫反应，其免疫效力接近商品化的多肽疫苗，且抗原制备过程简单方便。虽然B (T1BT2) 4B重组蛋白的免疫效力还需在猪体上进一步验证，但研究思路为FMDV基因工程亚单位疫苗的研究提供了借鉴。

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(本文责编 陈宏宇)

Design and immunogenicity evaluation for the bacteria-like particle vaccine against swine type O foot-and-mouth disease virus

Liting Hou1,2, Jin Chen2, Xuwen Qiao2, Xiaoming Yu2, Jibo Hou2,3, Qisheng Zheng2, and Jinnian Li1
1College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei230036,Anhui,China
2National Research Center of Veterinary Biological Engineering and Technology,Nanjing210014,Jiangsu,China
3Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses,Yangzhou225009,Jiangsu,China

Based on gram positive enhancer matrix displaying technology, we designed and evaluated a bacteria-like particle vaccine against swine type O Foot-and-mouth disease virus. Three optimized genes of type O Foot-and-mouth disease virus strain Mya98 were cloned into recombinant prokaryotic expression vector pQZ-PA and renamed as pQZ-BT1B-PA, pQZ-BT2B-PA and pQZ-B (T1BT2) 4B-PA, fused with an anchor protein (PA) binding to Gram-positive enhancer matrix (GEM) particles specifically. The protein expression was identified with SDS-PAGE and Western blotting, and then purified with GEM particles. Five-week old female mice were randomly divided into six groups and all the immunization was developed according to subcutaneous injection. Mice in the first three groups were injected with 50 μg/dose GEM-BT1B, GEM-BT2B and GEM-B (T1BT2) 4B, respectively. Mice in the fourth group were immunized with commercial peptide vaccine as positive control. The fifth group vaccinated with hostE. colitransformed with pQZ-PA fulfilled as negative control. Mice in the last group injected with sterile PBS served as blank control. The humoral immunity of recombinant protein vaccine was evaluated with peptide-specific antibody and LPB antibody. The cellular immunity was evaluated with lymphocyte proliferation test and cytokine expression detection. SDS-PAGE and Western blotting showed that the most part of soluble target fusion protein have been purified and displayed on GEM particles. Vaccine GEM-B (T1BT2) 4B stimulated mice produce not only higher level of specific antibody against peptide and Foot-and-mouth disease virus specific liquid phase blocking antibody, but also more vigorous spleen lymph proliferation and higher levels of Th1 type cytokines. To summarize, vaccine of GEM-B (T1BT2) 4B possessed good immunogenicity and opened a new way for further Foot-and-mouth disease virus subunit vaccine design.

Foot-and-mouth disease virus, VP1 protein, soluble expression, bacteria-like particles, immunogenicity

s:Qisheng Zheng. Tel: +86-25-84392088; E-mail: njcvc1302@163.com

Received:June 22, 2016;Accepted:November 9, 2016

Supported by:The Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No. 201303046), the Independent Innovation of Agricultural Sciences Program of Jiangsu Province (No. CX(14)2089).

Jinnian Li. Tel: +86-551-3388375; E-mail: Lijinnian2000@163.com

公益性行业 (农业) 科研专项 (No. 201303046)，江苏省农业自主创新专项 (No. CX(14)2089) 资助。

时间：2016-12-09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20161209.1551.002.html