银鲳不同组织中4种同工酶的表达差异

刘 磊，张晨捷，彭士明，高权新，施兆鸿

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

银鲳不同组织中4种同工酶的表达差异

刘 磊1，2，张晨捷1，彭士明1，高权新1，施兆鸿1，2

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析了银鲳（Pampus argenteus）脾脏、肝脏、肌肉、心脏、肾脏等5种组织中酯酶（EST）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、乙醇脱氢酶（ADH）等4种同工酶的表达模式，并对各种同工酶的酶谱进行了分析。结果表明：这4种同工酶在银鲳5种组织中的分布均存在一定的组织特异性，其与各组织的生理机能密切相关。银鲳4种同工酶共记录出61条酶带，其中EST被检测出的酶带数量最多也较复杂，ADH同工酶酶带数量最少，只有6条酶带被检测到，LDH和GDH分别检测到16条和9条酶带；组织特异性主要表现在位点表达和酶活性强弱不同这两个方面，GDH1和ADH2只在肝脏中表达。

银鲳；同工酶；组织特异性

同工酶（isozyme）是指由一个或多个基因座位编码、存在于同一种（或属）的生物或同一个体的不同组织中，甚至存在同一组织或同一细胞中，催化同一种化学反应，但酶分子结构有所不同的一类酶。同工酶在生物发育分化及代谢调节中必不可少，鱼类同工酶的研究始于1960年，至今技术已经十分成熟，研究方法较多。作为一种生化遗传指标，已经广泛用于鱼类物种鉴定［1－2］、亲缘关系分析［3－4］、种群遗传［5－6］、系统发育［7］等各个方面。

银鲳（Pampus argenteus）属鲈形目鲳亚目鲳科鲳属，为暖温性近海中上层集群性经济鱼类［8］，银鲳主要分布于印度洋、印度-太平洋区、朝鲜和日本西部海域，在中国沿海地区也有分布［9］，是东海主要捕捞经济鱼类之一，属名贵食用鱼类。迄今对银鲳的研究，主要集中在种群洄游和资源量评估［9－10］、资源动态［8－11］、生殖力及人工繁养殖［12－14］、生理及生态［15－17］等方面。而对银鲳同工酶的研究还较少，本研究对银鲳4种同工酶［酯酶（EST）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、乙醇脱氢酶（ADH）］进行了组织特异性的初步分析，以期为其种质资源、人工选育和遗传研究提供同工酶谱和生化遗传学的参考指标。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验鱼取自江苏省启东的上海市水产研究所启东科研基地，为东海水产研究所本所自行繁育的1龄银鲳，从养殖池中随机捞取10 ind，平均体质量为（18.8±7.2）g，平均叉长为（9.1± 1.1）cm。采样时间为2015年8月。

1.2 酶液样品制备

解剖银鲳，迅速摘取脾脏、肝脏、肌肉、心脏、肾脏5种组织，冲去血污，于滤纸上静置吸去水分，装入管中冷冻备用。实验时，切取一小块样品，加入预冷的磷酸缓冲液（0.1 M，pH 7.0），加入比例按照1∶4（质量／体积），匀浆机中匀浆后4℃静置3 min，然后12 000转离心10 min，取上清液备用。取等体积的上清液与上样缓冲液（20%的蔗糖溶液与1%的溴酚蓝）混匀即可上样电泳。

1.3 电泳方法

采用不连续聚丙烯酰胺垂直平板电泳。浓缩胶的浓度均为4%，pH值6.8；分离胶乳酸浓度为8%，其它浓度为12.5%，pH值8.8。电极缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸（Tris-Gly）。10 mA恒流预电泳1 h，电泳120 V恒压电泳，电泳时间各种酶有所不同。电泳结束后进行染色。

1.4 染色及酶谱分析

同工酶的染色方法参照文献［18－20］稍作改进，37℃避光染色，至条带出现后停止染色，蒸馏水冲洗，脱色后7%乙酸溶液保存，经相机拍照保存，照片经调光处理后使用。

EST同工酶染色方法如下：称取100 mg 4-苯甲酰氨基-2，5-二甲氧基氯化重氮苯氯化锌盐（Fast Blue RR Salt，简称固蓝RR盐）、50 mg乙酸-1-萘酯（1-Naphthyl acetate）和50 mg乙酸-2-萘酯（2-Naphthyl acetate）共同溶于10 mL丙酮中，待溶解完成后，加入90 mL 0.1 M磷酸溶液（PB），现配现用。

LDH同工酶染色液按照氧化型辅酶Ⅰ溶液（NAD＋，5 mg·mL－1）∶乳酸钠（1 mg·mL－1）∶氯化钠（0.1 M）∶氯化硝基四氮唑蓝（NBT，1 mg· mL－1）∶甲硫吩嗪（PMS，1 mg·mL－1）∶磷酸盐缓冲液（PBS，0.5 M pH 7.5）＝4.0∶2.5∶2.5∶10.0∶1.0∶5.0比例进行配制，现配现用。

GDH同工酶染色液按照氧化型辅酶Ⅰ溶液（NAD＋，5mg·mL－1）∶谷氨酸钠（1M pH 7.0）∶蒸馏水∶氯化硝基四氮唑蓝（NBT，1 mg·mL－1）∶甲硫吩嗪（PMS，1mg·mL－1）∶磷酸盐缓冲液（PBS，0.5 M pH 7.5）＝12∶5∶30∶30∶2∶25比例进行配制，现配现用。

ADH同工酶染色液按照氧化型辅酶Ⅰ溶液（NAD＋，5 mg·mL－1）∶95%乙醇∶蒸馏水∶氯化硝基四氮唑蓝（NBT，1 mg·mL－1）∶甲硫吩嗪（PMS，1 mg·mL－1）∶三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（Tris-HCl，0.2 M pH 8）＝5∶2∶20∶15∶1∶7比例进行配制，现配现用。

同工酶的命名［21］，以各酶带的相对迁移率（Rf）从大到小依次命名，即离阴极最近的编为1号，依次顺序编为2，3，4，……。

2 结果与分析

2.1 EST

从银鲳的EST电泳图谱（图1）可以看出，在银鲳的5种组织中都有EST的条带显示，但条带的颜色深浅不同，说明检测到了酯酶的活性，但活性强弱有所差别。比较银鲳5种组织中的EST电泳条带可知：肝脏是检测到EST同工酶最多的组织，酶带多且染色深，活性最强，其次是心和肌肉组织；肝和心脏中EST条带分布较均匀，肌肉中条带在EST6～EST12位点之间分布多于EST6位点之前；脾和肾中检测到的条带数目少且颜色浅，显示EST活性弱；脾是EST同工酶最少的组织，酶带少且染色浅，活性最弱，银鲳EST同工酶在5种组织中的表达具有显著的组织特异性。

图1 银鲳不同组织EST图谱Fig.1 EST pattems in various tissues of P.argenteus

2.2 LDH

在银鲳5种组织LDH同工酶图谱中，不同组织的LDH表现出明显的组织特异性（图2）。电泳图谱共检测到5条酶带，每种组织的酶带数2～5条不等。在脾脏中检测到2条酶带LDH4和LDH5，且LDH4染色较深，活性LDH4＞LDH5；在肝脏组织中共检测到5条酶带，活性强弱依据酶带深浅为LDH4＞LDH2＞LDH3＞LDH1＞LDH5；在肌肉组织中共检测到LDH4和LDH2两条酶带，其中LDH2染色极浅，其活性较弱；在心脏中检测到3条酶带，活性LDH5＞LDH4＞LDH2；肾脏中清晰的检测到4条酶带，其中LDH2和LDH3染色清晰，说明其稳定性强，LDH4染色最深，活性最强，LDH5染色最浅，活性最弱。综上，LDH1酶带只在肝组织中检测到，其它组织中并未发现LDH1酶带。

图2 银鲳不同组织LDH图谱Fig.2 LDH pattems in various tissues of P.argenteus

2.3 GDH

由银鲳的不同组织的GDH电泳图谱（图3）可见，GDH在银鲳脾、肝脏、肌肉、心脏、肾脏各组织中都有分布，共检测到5条酶带。其中GDH1仅在肝脏中检测到且染色较浅，活性比较弱；GDH2及GDH3在肾脏中检测到明显的条带，活性居中；而GDH4在5种组织中都有酶带出现，酶带较宽，在肝脏、肌肉和肾中染色较深，活性最强，心脏中的活性次之，在脾脏活性最弱；GDH5仅在心脏中检测到明显酶带，染色较深，活性较强。肾脏是检测到GDH同工酶最多的组织，有3条酶带，脾脏是GDH同工酶最少的组织，只检测到1条酶带，且染色较浅，活性弱，银鲳GDH同工酶在5种组织中的表达具有显著的差异性。

图3 银鲳不同组织GDH图谱Fig.3 GDH pattems in various tissues of P.argenteus

2.4 ADH

银鲳不同组织的ADH电泳图谱见图4，银鲳ADH同工酶共检测到2条酶带，ADH2仅在肝脏中检测到酶带，染色浅，活性低，在其它4种组织中未检测到ADH2活性。ADH1在银鲳脾、肝脏、肌肉、心脏、肾脏各组织中都检测到了酶带，但其染色程度有差异，在心脏中ADH1酶带染色最深，活性最强。肝脏中检测到2条酶带，其它组织只有1条酶带，且染色程度差异明显，ADH同工酶在银鲳5种组织中的表达具有一定的组织差异。

图4 银鲳不同组织ADH图谱Fig.4 ADH pattems in various tissues of P.argenteus

3 讨论

3.1 银鲳同工酶表达的组织特异性

表1 银鲳各组织同工酶酶带数统计表Tab.1 Enzyme band number in various tissues of P.argenteus

本实验对银鲳4种同工酶的研究发现，在5种组织中各种同工酶都有一定程度的表达，由表1可见，肝脏中酶的含量最为丰富，4种同工酶都检测到活性且总酶带数量最多，共检测到18条酶带，活性几乎是几种组织中最高的；其次为心脏；再次之为肌肉和肾脏；脾脏酶含量最少，共检测到5条酶带，且各酶带染色浅，说明其表达量较低，活性弱。肾脏中，EST酶表达较弱，只有3条酶带，且染色浅，活性低，而其余3种酶表达较活跃，仅次于肝脏中3种酶的表达。对卵形鲳鯵（Trachinotus ovatus）同工酶表达的研究发现［22］，EST同工酶在肝脏和肾脏中表达了两个座位，在肌肉、脾脏和心脏只表达一个座位，而与之不同，本研究中银鲳肾脏组织中EST同工酶表达弱；卵形鲳鯵LDH同工酶在肾脏中表达最强，而在脾脏中没有表达，这与本研究中银鲳的研究结果相类似，银鲳的LDH同工酶在肾脏中表达较强，而在脾脏中表达弱；卵形鲳鯵与本实验银鲳组织同工酶表达有异有同，说明同工酶在不同种之间表达也存在较大差异性。

银鲳5种组织的4种同工酶都表现出组织特异性，具体表现在以下2个方面：首先是位点的表达，某些位点的同工酶可能是某种组织所特有的，在其它组织中不表达或者活性太低无法检测到。比如ADH同工酶，在肝脏中检测到两条酶带，而其它组织中只检测到ADH1酶带，ADH2是肝脏组织中所特有的；又如GDH1仅在肝脏中检测到酶带，GDH5仅在心脏组织中检测到酶带，肝脏和肾脏中EST酶带数基本相同，但是其相同位点酶带表达有所差异，等等，以上这些说明组织特异性确实可表现在位点表达的差异上。其次，酶活性的强弱不同。同一位点在不同组织中的相对含量有所不同，其可通过染色深浅来加以判断。如ADH1在5种组织中都有表达，但在心脏组织中酶带颜色深，含量丰富，其次是肾脏和肌肉，活性最弱的是脾和肝脏；GDH4在5种组织中酶带相同，表达量不同，在肝脏、肌肉、肾脏中高表达，活性强，其次是心脏中，最弱的是在脾脏中。同时，不同位点在不同组织中的相对活性不同，如EST同工酶，在肝脏、肌肉、心脏中表达活跃，酶带数量多，而在脾和肾脏中检测到的酶带少，在肌肉中酶带集中于EST6～EST12之间，而肝脏和心脏中酶带分布均匀。

3.2 银鲳不同组织同工酶表达的特异性及其与功能的关系

硬骨鱼类的EST一般认为是单体或二聚体酶，由多个位点编码，多态现象非常普遍，条带多且复杂［23－24］。EST是一种水解酶类，除维持正常的能量代谢外，还可以水解非正常存在的酯类化合物，具有解毒的功能［25］。银鲳的肝脏和心脏中EST同工酶表达最强，这与肝脏的消化吸收、降解代谢废物和毒素等生理生化功能相关，心脏中酶表达强可能与其活跃的能量代谢相关，银鲳肌肉中EST同工酶表达仅次于肝脏和心脏，这可能与银鲳的习性有关，银鲳生性爱动，肌肉比较发达，这需要活跃的能量代谢，因此造成其EST同工酶高度表达。

LDH为四聚体［26－28］，是一种糖酵解酶，主要与乳酸的产生和利用有关［29］，它在无氧条件下能将丙酮酸还原为乳酸，产能以维持机体的能量需求。银鲳5种组织中共检测到5条酶带，肝脏中LDH活性表现的最强，肝脏高强度的生理活动需要消耗大量能量，LDH催化乳酸氧化形成丙酮酸，参与有氧代谢。肌肉是机体无氧代谢较为旺盛的组织，银鲳肌肉中LDH表现出2条酶带，主要是催化丙酮酸转化为乳酸，参与无氧代谢。一般认为C基因控制的LDH表型在部分鱼类的肝脏中表达［30］，而这与银鲳组织中特异的LDH1酶带相对应。

GDH是一种线粒体酶，GDH除催化L-谷氨酸脱氢外，还具有催化其它氨基酸如L-缬氨酸、L-2-氨基丁酸及L-亮氨酸脱氨，它以NAD、NADP或者同时利用两者作为辅酶，参与到谷氨酸的合成与分解中［31］。本研究中，在银鲳肾脏中检测到GDH同工酶3条酶带，肾脏具有排泄分泌代谢产物的功能，它还具有重吸收的功能，能够将氨基酸、葡萄糖等全部重吸收，重吸收的相关氨基酸能够参与谷氨酸的合成与再分解中，此过程GDH表现活跃，这与5种组织中肾脏GDH活性最强的实验结果相符合。

ADH是一种催化醇脱氢形成醛或酮的酶，一般为二聚体酶［23］。ADH同工酶大量存在于人和动物肝脏中，它的生理作用是适应厌氧酵解的需求。从本研究结果可以看出，肝脏中检测到2条ADH酶带，但染色颜色浅，肌肉、心脏和肝脏中只有1条酶带但染色深，活性强，这与昆明裂腹鱼（Schizothorax grahami）［32］及花鳗鲡（Anguilla marmorata）［27］的研究结果存在某些类似性，与胶齿鲷（Symphysodon spp.）［33］的研究结果有差异，其肝脏中染色深且十分稳定，其余组织染色浅且极易失活，这可能与人工养殖银鲳长期适应生存环境相关。

4 小结

本研究结果表明：银鲳的4种同工酶在酶带组成和表达的活性方面表现出高度的组织特异性，同工酶的表达差异与各组织执行的生理功能密切相关。同工酶的组织特异性表现在同工酶在组织中的表达活性强弱、位点表达特异性等。作为种质标准生化遗传学指标的同工酶电泳技术，同工酶的种类很多，不同标准有不同的检测方法，本研究选取了4种同工酶用来分析银鲳的生化遗传结构，可为将来制定银鲳种质标准提供技术参考。

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Differential expression of 4 kinds of isozyme in different tissues of Pampus argenteus

LIU Lei1，2，ZHANG Chen-jie1，PENG Shi-ming1，GAO Quan-xin1，SHI Zhao-hong1，2
（1.Key and Open Laboratory of Marine and Estuarine Fisheries of Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China；2.College of Fisheries and Life，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Isozyme，as a product of gene expression，is not only an important physiological index but also a reliable genetic index.It can provide valuable biochemical genetic indicators to study the tissue specificity of isozyme system，genetic diversity and variety improvement of Pampus argenteus.Polyacrylamide gel electrophoresis was used to investigate the expression pattern and isozyme zymogram of four isozymes（EST，LDH，GDH and ADH）in 5 tissues（spleen，liver，muscle，heart and kidney）of Pampus argenteus.The results showed that：four isozymes in the five tissues showed distinct specificities，which was attributed to the physiological functions of different tissues.A total of61 isozyme bands were examined，of which EST were the most complex and sufficient，6 isozyme bands were examined in ADH，the least in 4 kinds of isozymes，16 and 9 isoenzyme bands were examined in LDH and GDH respectively.EST was active in the liver and heart tissue，followed by muscle tissue，and then it showed in the kidney，the weakest expression in bands，distributed evenly in liver and heart，they mainly distributed from EST6 to EST12 in muscle；spleen LDH isozyme bands were examined in the liver，active strength was in the sequence of LDH4＞LDH2＞LDH3＞LDH1＞LDH5，4 and 3 isozyme bands were examined in the kidney and heart，2 isozyme bands in muscle and spleen tissue；3LDH isozyme bands were examined in kidney，2 isozyme bands in heart and liver，in muscle and spleen tissue；2 ADH isoenzyme bands were examined in the liver，and in other tissues respectively.Tissue specificity was mainly expressed in two aspects：different site expressions and enzyme activities，for example，GDH1 and ADH2 isozyme bands were only present in liver，EST was active in the liver and heart tissue，LDH1 isozyme bands was only present in liver tissue.In this paper，4 kinds of isozymes show a high level of tissue specificity in enzyme site expression and activity，and the expression of isozyme differences is closely related to the physiological functions.The paper will provide technical references for Pampus germplasm standards in the future.

Pampus argenteus；isozyme；tissue specificity

S 965.3

：A

1004－2490（2017）01－0068－08

2016－01－09

国家科技支撑项目（2011BAD13B01）

刘 磊（1990－），男，硕士研究生，从事海水鱼类养殖生物学研究。E-mail：Katharineyaya＠126.com

施兆鸿，研究员。Email：shizh＠eastfishery.ac.cn