骨髓穿刺活检组织快速处理的新方法

2017-03-01刘禄杨娜夏勤夏娟刘智李林丰张薇珊罗启翅崔丽娟

海南医学 2017年1期

关键词：冰乙酸病理科氨水

刘禄，杨娜，夏勤，夏娟，刘智，李林丰，张薇珊，罗启翅，崔丽娟

(遂宁市中心医院病理科1、检验科2，四川遂宁 629000)

骨髓穿刺活检组织快速处理的新方法

刘禄1，杨娜2，夏勤1，夏娟1，刘智1，李林丰1，张薇珊1，罗启翅1，崔丽娟1

(遂宁市中心医院病理科1、检验科2，四川遂宁 629000)

目的介绍本科室探索的一种骨髓穿刺组织的快速脱钙处理方法。方法通过查阅参考文献、细致研究病理科常用试剂理化特性结合骨髓穿刺组织特点，试验出一种骨髓穿刺组织快速脱钙方法。结果采用本方法处理骨髓穿刺组织简便快捷，仅需2～4 h；骨髓组织处理质量满意，各造血系统细胞染色鲜明、透亮，示细胞核与细胞质对比度清晰；骨小梁脱钙完全，结构清楚，呈鲜艳红色，免疫组织化学染色高质量阳性显色，低背景着色，无非特异性显色的特点。结论该方法是较为简便实用的骨髓组织快速处理方法，提高工作效率，值得在病理科工作中推广采用。

骨髓；穿刺组织；快速处理；新方法

病理科诊断工作中，骨髓穿刺活检是其中重要一项。对骨髓组织的脱钙处理是病理技术的核心环节，骨髓组织的高效快速脱钙处理是病理诊断的先决条件。本文在查阅文献基础上，结合本科室的长期探索，现介绍一种骨髓组织的快速脱钙方法。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂中性甲醛溶液(浓度37.5%～40.0%)，冰乙酸溶液(浓度99.7%)，氨水(浓度25.0%～28.0%)，浓盐酸(浓度37.5%)，无水乙醇(浓度99.7%)，以上试剂均为分析纯级(AR级)，购自成都科隆化工试剂厂(成都，科隆)；去离子水由科室自制；组织脱水机：LEICAASP300S，组织包埋机：LEICA EG1150H，全自动HE染色机：LEICA AUTO STAINER XL均购自德国徕卡公司(德国，徕卡)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓处理液配置本方法中对骨髓穿刺组织处理由三种处理液组成：1)骨髓固定及预脱钙液(AAF液)；2)骨髓快速脱钙液(15%盐酸)；3)骨髓脱钙后平衡液(1%氨水)。具体配置为：1)AAF液100 mL (中性甲醛10 mL，无水乙醇80 mL，冰乙酸5 mL，去离子水5 mL)；2)15%盐酸100 mL(浓盐酸15 mL，去离子水85 mL)；3)1%氨水100 mL(氨水1 mL，去离子水99 mL)。以上处理液配置完成后密封保存置室温过夜后即可使用。

1.2.2 骨髓处理流程临床骨髓穿刺组织标准大小为长约2 cm，直径0.4 cm，使用柔软透水性的显微镜擦镜纸包裹骨髓穿刺组织后，进行以下处理：(1)骨髓固定及预脱钙：置AAF液30 min～2 h，根据骨髓组织硬度调整处理时间，标准大小的骨髓组织处理时间为1.5 h，散碎或较小骨髓组织处理时间为30 min～1 h，骨组织成分较多的骨髓组织处理时间可延长至2 h，流水冲洗1min，去除残留的AAF液后，转入无水乙醇1 h，该步骤利用无水乙醇的中性脱水特点将AAF液处理后的骨髓组织进一步脱水固定并且尽量保护骨髓中的造血系统细胞。(2)骨髓快速脱钙：将经过固定和预脱钙处理后的骨髓组织转入15%盐酸10～40 min，期间需每10 min使用探针刺入骨髓组织，可轻松刺入即为脱钙完全，标准大小的骨髓组织处理时间为30 min，散碎或较小组织时间多为10～15 min，并且需持续观察，以免过度脱钙而导致组织溶解为细胞液，骨组织成都较多骨髓组织处理时间可延长至40 min，流水冲洗1 min，去除残留的盐酸溶液，该步骤将骨髓穿刺组织快速脱钙完成。(3)骨髓脱钙后平衡：将快速脱钙后的骨髓组织转入1%氨水10 min，1%氨水为弱碱性可持续提供OH-离子中和残留的盐酸H+离子，流水冲洗1 min。至此，骨髓组织处理完成，再经脱水、浸蜡、包埋、制片、HE染色，或进行免疫组织化学染色。

2 结果

本科室采用本方法处理骨髓组织440例，处理期间观察骨髓组织变为较透亮，探针可轻松刺入骨髓组织为脱钙完成。在我科多数标本可在3 h完成脱钙处理，再经脱水、浸蜡、包埋、制片、HE染色后，骨髓组织中各造血系统细胞染色鲜明、透亮，骨小梁脱钙完全，结构清楚，呈鲜艳红色(图1)，细胞核与细胞质对比度清晰(图2)，免疫组织化学染色MPO(图3)，免疫组织化学染色CD79α(图4)。

图1 骨髓组织中各造血系统(HE 10×4)

图2 骨髓组织中造血细胞核与细胞质对比(HE 10×20)

图3 骨髓组织免疫组化染（抗体标记：MPO；HE 10×10）

图4 骨髓组织免疫组化染(抗体标记：CD79α；HE 10×20)

3 讨论

骨髓组织中骨小梁的无机盐主要为磷酸钙及碳酸钙，质地坚硬，直接制片非常困难，且切片质量较差。

目前，病理科骨髓组织制片有两种方法：其一是塑料包埋直接切片法[1]，该方法采用合成塑料直接包埋骨髓后进行切片、HE染色，虽省去脱钙步骤，但存在以下缺点：包埋剂使用塑料为商品化产品价格较昂贵，含有毒性且制片时间较长(5～7 d)[2-3]。包埋剂配制比例、塑料聚合时间，切片使用刀口、切片机性能，病理技术人员的技术要求，捞片、烘干等技术环节均有较高要求[4]。由于以上原因，本科室采用传统的酸溶脱钙法[5]进行骨髓组织处理。

本方法首先采用AAF液对骨髓组织处理，AAF液中甲醛为组织固定剂，具有较强的穿透力，通过网格状交联蛋白质分子而达到固定组织的作用，对组织收缩作用小且均匀，并能减少酸对组织的侵蚀[6]，可先将骨髓组织中的造血细胞，纤维结缔成分进行有效固定，保护组织及细胞形态。乙醇为良好的脱水剂，可起到脱水效果并兼具固定作用，骨髓组织中含有丰富的脂肪成分，乙醇可溶解该成分便于制片[7]。冰乙酸为弱酸，能够温和地持续提供H+，可以溶解骨髓中的钙质，在骨髓组织固定的过程中该成分起到脱钙效果，从而减少脱钙所用时间[7]。

本方法对骨髓组织脱钙主要步骤为采用盐酸进行处理，盐酸与硫酸和硝酸同为无机强酸，均能够提供强H+来溶解骨小梁中钙盐。但后两者缺陷[8]为：硫酸的酸根可与钙离子形成难溶的硫酸钙沉淀而使骨髓重新变硬。硝酸在溶解钙盐的同时可产生含氮化合物使组织蛋白质变性形成黄蛋白反应，且甲醛可被硝酸氧化变性而失去固定效果，同时降低硝酸浓度[9]。本方法中采用盐酸浓度为15%(体积分数：37.5%浓盐酸15份+去离子水85份)，有文献报道无机酸对骨髓组织细胞及免疫组织化学的影响关键在于酸与骨髓的作用时间，即时间越长，组织损伤越大[10]。本科室在参考文献经验报道[11-12]及不断试验的基础上，最终确定为15%盐酸(体积分数)作用2 h内效果最佳。

本方法最后采用1%氨水(体积分数)来浸泡脱钙后骨髓组织，目的在于利用氨水的弱碱性可温和地持续提供OH-来中和残存的H+，且氨水极易洗脱而无残留。有文献报道，采用混合酸脱钙及EDTA双重脱钙固定后进行免疫组织化学染色[13]。该方法中采用两组脱钙液：脱钙液A(甲酸、甲醛、冰乙酸、浓盐酸、氧化铝、氯化钠)作用3 h，冲洗1 h，脱钙液B(EDTA，盐酸)作用2 h来完成脱钙程序，可获得较好的免疫组化染色效果。本文方法与上述方法相比具有以下优势：(1)脱钙液试剂种类少，本文方法脱钙液仅两种，以冰乙酸为预脱钙，以15%盐酸为主进行快速脱钙。上述方法中脱钙液配制试剂种类达8种，且配置方法繁琐；(2)脱钙程序简便，时间短，本文方法脱钙步骤仅为10～40 min即可完成，采用1%氨水处理脱钙后骨髓组织，采用弱碱OH-离子迅速去除残留H+。上述方法两组脱钙液需作用5 h，中间需冲洗1 h，总时间达6 h，时间多于本文方法。本文方法处理后的骨髓组织进行免疫组织化学染色能够保证高质量阳性显色，低背景着色，无非特异性显色的特点。

本方法将组织固定和脱钙两个步骤有效的结合，所用时间为2～4 h，相较于刘增辉等[14]报道方法具有步骤简便，方法快速，所用试剂种类少，配制方便等优点。

综上所述，该方法是较为简便实用的骨髓组织快速处理方法，在病理科技术工作中需要细致用心地做好每个环节，认真钻研，不断探索尝试才能不断提高效率，制作更高质量的病理切片。

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