大肠杆菌JH-B2产L-丙氨酸发酵工艺的研究

付 刚， 付相敏， 刘 枣， 王金华， 王永泽

(1 湖北工业大学生物工程与食品学院， 湖北 武汉 430068； 2 滨州市力之源生物科技有限公司，山东 滨州 256600)

大肠杆菌JH-B2产L-丙氨酸发酵工艺的研究

付 刚1，2， 付相敏1， 刘 枣1， 王金华1， 王永泽1

(1 湖北工业大学生物工程与食品学院， 湖北 武汉 430068； 2 滨州市力之源生物科技有限公司，山东 滨州 256600)

L-丙氨酸在医药和食品行业中有着非常广泛的应用，利用大肠杆菌生产L-丙氨酸具有生产周期短和营养要求低的特点。以一株经过基因改造的大肠杆菌JH-B2(ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔldhA,ΔpflB∷alaD)作为发酵菌株，研究其以葡萄糖为碳源配以少量氮源(5g/L酵母粉)发酵产L-丙氨酸的条件，对比分批发酵和补料发酵的结果，并在50L的发酵罐中进行了发酵的放大。研究结果表明，优化后发酵条件为：转速300r/min，pH6.0，通气量0.6L/((min·L))。其中，pH为6.0接近于L-丙氨酸的等电点。在此条件下L-丙氨酸产量可达76.51g/L，比优化前提高12.5%；7-L发酵罐中补料发酵相比分批发酵产量提高了40%；在50L发酵罐中进行补料发酵，L-丙氨酸产量达到135.0g/L。

L-丙氨酸； 发酵； 大肠杆菌

L-丙氨酸是一种人体非必需氨基酸，但其在食品和医药等领域具有广泛的用途，可作为手术前后营养品[1]，亦可作为合成蛋白质所需的原料[2]。除此之外，在工程塑料制造方面，L-丙氨酸也具备很大的商业价值，因此国内L-丙氨酸的市场价格较高，约为2.5万元/t。目前L-丙氨酸生产成本较高[3]，其大规模应用受到一定的限制[4]。由于大肠杆菌具有生长快和营养要求低等特点，采用大肠杆菌生产L-丙氨酸，可在一定程度上降低L-丙氨酸生产成本。徐友强[5]等利用重组大肠杆菌，以富马酸为底物，采用生物转化的方法将其转化为L-丙氨酸，产量达到112.5g/L。此外，还可通过基因工程手段，将外源丙氨酸脱氢酶基因导入大肠杆菌，使大肠杆菌利用葡萄糖合成L-丙氨酸，并通过代谢途径的优化，使L-丙氨酸产量和光学纯度大大提高[6]。周丽[7]等利用重组大肠杆菌，以初始葡萄糖浓度30g/L作为碳源，经补料发酵工艺最终得到67.2g/LL-丙氨酸。

本文以一株经过前期基因工程改造的大肠杆菌JH-B2(ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔldhA,ΔpflB∷alaD)作为发酵菌株。该菌株具有需要有机氮源更少、发酵速度快等优点。首先评估发酵转速、pH、通气量对L-丙氨酸发酵产量的影响。在此基础上，进一步研究分批发酵与补料发酵的区别，并在50L的发酵罐中进行了补料发酵的放大，以期为大规模发酵L-丙氨酸提供发酵参数和工艺条件。

1 材料与方法

1.1 菌株

大肠杆菌JH-B2(ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔldhA，ΔpflB∷alaD)，出发菌株为大肠杆菌EscherichiacoliW(ATCC 9637)，经过基因工程手段构建而成，甘油管-20℃中保存。

1.2 培养基

活化培养基：七水硫酸镁 0.5 g/L，一水硫酸锰 0.05 g/L，磷酸二氢钾 1.5 g/L，磷酸氢二钾 3.6 g/L，NaCl 5 g/L，酵母粉 2 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L。

摇瓶种子培养基：七水硫酸镁 0.5 g/L，一水硫酸锰 0.05 g/L，磷酸二氢钾 1.5，磷酸氢二钾 3.6 g/L，酵母粉 2 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖 20 g/L。

发酵培养基：硫酸铵 30 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，一水硫酸锰 0.05 g/L，磷酸二氢钾 1.5 g/L，磷酸氢二钾 3.6 g/L，酵母粉 1 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖 120 g/L，聚醚消泡剂 1.0 g/L。

1.3 大肠杆菌JH-B2发酵产L-丙氨酸的条件

1.3.1 菌种活化及种子培养

菌种活化：用灭菌后的竹签从甘油管中蘸取菌液，划线至活化培养基中，置于恒温培养箱37℃培养24 h，连续活化2～3代。

摇瓶种子培养：从活化好的平板培养基上划取少量菌落，接入400 mL摇瓶种子培养基中，摇床37℃培养12 h。

1.3.2 培养条件的优化

1)转速的优化

将培养好的摇瓶种子培养液(菌液OD值为1.0～1.5，pH为5.0～5.5)以10%接种量接种至含有1800 mL培养基的发酵罐中，以7.47 mol/L氨水作为发酵中和剂，初始葡萄糖浓度80 g/L。设定pH值6.0，温度37℃，通气量0.6 L/(min·L)，转速分别设置为100、200、300、400、500 r/min。

2)通气量的优化

将培养好的摇瓶种子培养液(OD为1.0～1.5，pH为5.0～5.5)以10%接种量接种至含有1800 mL培养基的发酵罐中，以7.47 mol/L氨水作为发酵中和剂，初始葡萄糖浓度140 g/L。设定pH值6.0，温度37℃，转速300 r/min，通气量分别设置为2、4、6、8、10 L/min。

3)pH的优化

将培养好的摇瓶种子培养液(OD为1.0～1.5，pH为5.0～5.5)以10%接种量接种至含有1800 mL培养基的发酵罐中，以7.47 mol/L氨水作为发酵中和剂，初始葡萄糖浓度140 g/L。设定温度37℃，转速300 r/min，通气量6 L/min，pH分别设置为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 L/(min·L)。

1.3.3 不同发酵方式的比较

1)分批发酵培养

将培养好的摇瓶种子培养液(OD为1.0～1.5，pH为5.0～5.5)以10%接种量接种至含有1800 mL培养基的发酵罐中，以7.47 mol/L氨水作为发酵中和剂，初始葡萄糖浓度140 g/L。设定pH值0.6 L/(min·L)，温度37℃，转速300 r/min，通气量0.6 L/(min·L)，发酵重复三次。

2)分批-补料发酵培养

将培养好的摇瓶种子培养液(OD为1.0～1.5，pH为5.0～5.5)以10%接种量接种至含有1800 mL培养基的发酵罐中，以7.47 mol/L氨水作为发酵中和剂，初始葡萄糖浓度80 g/L，发酵至24 h时，补充葡萄糖浓度至60 g/L。设定pH值6.0，温度37℃，转速300 r/min，通气量0.6 L/(min·L)，发酵重复三次。

1.3.4 50 L发酵罐发酵L-丙氨酸 将培养好的摇瓶种子培养液(OD为1.0～1.5，pH为5.0～5.5)以10%接种量接种至含有27 L培养基的发酵罐中，以7.47 mol/L氨水作为发酵中和剂，初始葡萄糖浓度80 g/L，发酵至24 h时，补充葡萄糖浓度至于60 g/L。设定pH值6.0，温度37℃，转速300 r/min，通气量0.6 L/(min·L)。

1.3.5 发酵终点判断 通过检测残糖含量小于1 g/L时，确定发酵终点。发酵结束后，升温至60℃维持30 min。

1.4 分析检测方法

1.4.1 发酵液OD值检测方法 取1 mL样品稀释一定倍数，利用分光光度计在600 nm波长处检测吸光度，使显示值在0.2～0.8之间。

1.4.2 葡萄糖的检测方法 取适量样品10 000 r/min离心5 min，取上清液稀释100倍，利用生物传感仪(SBA-40D)测定葡萄糖含量。

1.4.3 L-丙氨酸检测方法 Waters e2695高效液相色谱，依力特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)，流动相甲醇-磷酸氢二钠混合液(V(pH为6.5的0.05 mol/L磷酸氢二钠)∶V(甲醇)=1∶9)，流速0.8 mL/min，柱温30℃，进样体积5 μL，检测波长215 nm。

2 结果与分析

2.1 搅拌转速的优化

设定pH值为6.0，温度37℃，通气量0.6 L/(min·L)，转速分别设置为100、200、300、400、500 r/min来考察转速对发酵的影响。

图 1 搅拌转速对大肠杆菌发酵L-丙氨酸的影响

由图1可知，L-丙氨酸产量随发酵罐转速的提高而增加。当转速为300 r/min时，产量最大77.12 g/L；当转速大于300 r/min时，产量不再增加。结果表明，发酵转速是影响摇瓶供氧的重要因素，适当氧气量的供应可以促进辅酶I的高效回复利用和代谢的高效运行[3]，这有利于丙氨酸的积累。

2.2 通气量的优化

设定pH值6.0，温度37℃，转速300 r/min，通气量分别设置为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 L/(min·L)来考察不同通气量对发酵的影响。

图 2 通气量对大肠杆菌发酵L-丙氨酸的影响

由图2可以看出，L-丙氨酸产量与通气量大小成正相关关系。当通气量小于0.6 L/(min·L)时，L-丙氨酸产量随通气量增大而增加；当通气量大于0.6 L/(min·L)时，L-丙氨酸产量增长缓慢。通气量直接关系到发酵液中溶氧值大小，但并非通气量越大越好。当通气量达到一定值时，产物产量不再明显提高，发酵能耗反而会进一步增加，而且通气量太大会使发酵液飞溅至管壁，容易造成染菌，通气量6 L/min为大肠杆菌工程菌发酵产L-丙氨酸的适宜条件。

2.3 pH的优化

设定温度37℃，转速300 r/min，通气量0.6 L/(min·L)，pH分别设置为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8和7.0来考察pH对发酵影响。

图 3 pH值对大肠杆菌发酵产L-丙氨酸的影响

由图3可知，发酵液pH值为6时，L-丙氨酸产量最高。这可能是由于L-丙氨酸等电点为6.02，因此在pH为6.0时L-丙氨酸溶解度最小，发酵液中L-丙氨酸浓度最小，对菌体反馈抑制作用最弱[8]。

2.4 7 L发酵罐分批发酵

设定pH值6.0，温度37℃，转速300 r/min，通气量0.6 L/(min·L)进行了分批发酵实验。

图 4 7 L发酵罐中利用大肠杆菌分批发酵产L-丙氨酸

由图4可知：0～12 h葡萄糖消耗较慢，产物增加较小，说明大肠杆菌基本还处于生长的延滞期；发酵12 h以后，耗糖速度和产酸速度明显提高，发酵进入了产酸旺盛阶段，整个发酵过程中产物的积累基本在这个阶段完成，最终L-丙氨酸积累量为95 g/L。

2.5 7 L发酵罐补料发酵

设定pH值6.0，温度37℃，转速300 r/min，通气量0.6 L/(min·L)进行补料发酵，初糖浓度为80 g/L，当发酵液中残糖低于1 g/L时，补料一次，使葡萄糖浓度达到60 g/L，继续发酵至残糖低于1 g/L，结束发酵(图5)。

图 5 7 L发酵罐中利用大肠杆菌补料发酵产L-丙氨酸

从图5可看出：0～8 h时耗糖速度和产物生成速度较慢；20 h后，耗糖速度和产物速度快速提高；当发酵至46 h 时L-丙氨酸积累量为133 g/L。

2.6 50 L发酵罐补料发酵

设定pH值6.0，温度37℃，转速300 r/min，通气量0.6 L/(min·L)，在50 L发酵罐中进行了L-丙氨酸发酵。初糖浓度为80 g/L，当发酵液中残糖低于1 g/L时，补料一次，使葡萄糖浓度达到60 g/L，继续发酵至残糖低于1 g/L，结束发酵(图6)。

图 6 50 L发酵罐中利用大肠杆菌补料发酵产L-丙氨酸

由图6可知：0～4 h时产物积累量很少；发酵4 h以后进入产酸期，大量积累产物L-丙氨酸；40 h发酵就已结束。整个发酵过程生产强度3.38 g/(L·h)，L-丙氨酸产量135 g/L。

2.7 不同发酵方式的比较

从表1中可以看出，不同发酵方式以及不同发酵规模对L-丙氨酸发酵都有一定影响。在7 L发酵罐中，补料发酵明显比分批发酵效果要好，前者转化率达95%，后者仅为68%；补料发酵最大生产强度和平均生产强度均高于分批发酵。一般来说，分批发酵初始葡萄糖浓度过高对菌体生长不利，延长了发酵周期，从本文研究结果也可看出，分批发酵发酵56 h后发酵液中还有40 g/L的葡萄糖残留。而分批-补料发酵初始葡萄糖浓度仅为80 g/L，发酵46 h基本无残糖，发酵转化率大于95%。

表1 不同发酵方式L-丙氨酸发酵的效果

补料发酵从工艺上讲，操作并不复杂，但其平均生产强度为2.90 g/(L·h)，不但高于分批发酵，对其他形式工艺操作也具有一定优势，如文献[7]同样利用大肠杆菌，以葡萄糖作为碳源，发酵分好氧和厌氧两阶段进行发酵，其L-丙氨酸最终产量67.2 g/L，转化率67.2%，L-丙氨酸生产强度2.01 g/(L·h)。

从发酵规模来看，50 L发酵罐中的效果比7 L发酵罐中的发酵效果有一定提高，发酵产量可达135 g/L。50 L发酵罐中发酵L-丙氨酸时糖酸转化率97%，而7 L发酵罐中转化率仅仅为95%；前者最大生产强度和平均生产强度均高于后者，表明本文菌株在适应大规模发酵生产L-丙氨酸上具有很大的潜力。

3 结论

本文以一株经过基因工程改造的大肠杆菌JH-B2(ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔpflB∷alaD,ΔldhA)作为发酵菌株，对L-丙氨酸发酵工艺条件进行了探索。1)转速小于300r/min范围内，随转速增大，L-丙氨酸产量随之增加；当通气量小于0.6L/(min·L)时，L-丙氨酸产量随通气量增大而增加；发酵液pH值为6时即在丙氨酸等电点附近时，L-丙氨酸产量最高。

2)对比了补料发酵和分批发酵产L-丙氨酸的发酵效果。结果表明，采用初糖80g/L补料60g/L的补料发酵方式，L-丙氨酸可达133.5g/L，比分批发酵(95g/L)产量高出40%，生产强度也有很大提高，达2.90g/(L·h)。

3)50L发酵罐中的效果比7L发酵罐中的发酵效果有一定提高。50L发酵罐中发酵L-丙氨酸时糖酸转化率97%，而7L发酵罐中转化率为95%；前者最大生产强度和平均生产强度均高于后者，表明菌株在适应大规模发酵生产上具有很大的潜力。

[1]HolsP,KleerebezemM,SchanckAN,etal.ConversionofLactococcuslactisfromhomolactictohomoalaninefermentationthroughmetabolicengineering.[J].NatureBiotechnology, 1999, 17(6):588-92.

[2]LeeM,SmithGM,EitemanMA,etal.Aerobicproductionofalanineby,EscherichiacoliaceFldhA,mutantsexpressingthe,BacillussphaericusalaD,gene[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology, 2004, 65(1):56-60.

[3] 周丽, 邓璨, 崔文璟,等. 利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸[J]. 现代食品科技, 2016(6):163-169.

[4]DinariSMM.ProgressinSyntheticPolymersBasedonNaturalAminoAcids[J].JournalofMacromolecularSciencePartA, 2011,PartA(8):644-679.

[5] 徐友强, 马玉岳, 姚粟,等. 重组大肠杆菌转化富马酸生产L丙氨酸[J]. 生物加工过程, 2016, 14(2):7-11.

[6]SmithGM,LeeSA,ReillyKC,etal.Fed-batchtwo-phaseproductionofalaninebyametabolicallyengineeredEscherichiacoli[J].BiotechnologyLetters, 2006, 28(20):1695-700.

[7] 周丽, 邓璨, 崔文璟,等. 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸[J]. 微生物学通报, 2015, 42(11):2272-2281.

[8] 邓辉, 陈存武, 孙传伯,等. 大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶突变体的构建及抗反馈抑制效应[J]. 生物工程学报, 2016, 32(4):468-477.

[责任编校： 张 众]

Research on L-alanine fermentation by Escherichia coli JH B2

FU Gang1,2, FU Xiangmin1, LIU Zao1, WANG Jinhua1, WANG Yongze1

(CollegeofBioengineeringandFoodScience，HubeiUniv.ofTech.，Wuhan430068China； 2BinzhouLIZHIYUANBiologicalTech.Co.Ltd.,Binzhou256600,China)

L-alanine has been widely used in the pharmaceutical and food industries. The production of L-alanine byEscherichiacolihasthecharacteristicsofshortfermentationtimeandminimalnutritionalrequirement.Inthisstudy,EscherichiacoliJH-B2 (ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔldhA,ΔpflB∷alaD)wasevaluatedforfermentativeproductionofL-alanineusingbatchandfed-batchmodes.Theresultsachievedinbatchfermentationshowedthattheoptimizedfermentationconditionswereasfollows:rotationspeedof300r/min,controllingpHof6.0 (approximatelyequivalenttotheisoelectricpointofL-alanine),andaerationrateof0.6L/(min·L).Undertheseconditions,theL-alaninetiterreachedto76.51g/Linthebatchfermentation,whichwas12.5%higherthanthatproducedinpreviousfermentationwithoutoptimizedcondition.Furthermore,L-alaninetiterachievedinafed-batchmodewas40%higherthanobtainedinbatchmode.Ina50Lfermenterwithafed-batchmode,thetiterofL-alaninereached135.0g/L.

L-alanine；fermentation；Escherichia coli

2016-11-17

湖北省自然科学基金项目(2011CDB076；2011CDA008)，湖北省教育厅项目(B20121402)

付 刚(1969-)， 男， 山东滨州人，湖北工业大学硕士研究生，研究方向为生物化工

1003-4684(2017)01-0116-05

Q

A