滇桂艾纳香多糖的分离纯化及单糖组成分析

许子竞，刘 茜，舒群威，张志红

(1.贵州工程应用技术学院天然产物中心，中国 毕节 551700；2.梧州学院化学工程与资源再利用学院，中国 梧州 543000)

滇桂艾纳香多糖的分离纯化及单糖组成分析

许子竞1，刘 茜2，舒群威1，张志红1

(1.贵州工程应用技术学院天然产物中心，中国 毕节 551700；2.梧州学院化学工程与资源再利用学院，中国 梧州 543000)

以滇桂艾纳香干燥全草为原料，以水为溶剂提取多糖BRP，经过D101大孔树脂脱色，DEAE-纤维素柱分离，依次用水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，得BRP-0，BRP-1.5，BRP-3和BRP-4四个洗脱部分；将BRP-0，BRP-1.5采用Sevage法脱蛋白、活水透析和Sephadex G-15柱层析，再经琼脂糖Sepharose 6FF柱层析分离纯化，得到BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4五个组份；GPC检测其相对分子质量、分子质量分布及峰型，确定它们为均一组分多糖；HPLC分析结果显示，BRP-0和BRP-1.5主要由鼠李糖、果糖和半乳糖组成，其物质的量之比大致为：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

滇桂艾纳香多糖；DEAE-纤维素分离；凝胶色谱纯化；HPGPC检测；单糖分析

滇桂艾纳香(Blumeariparia(BL.) DC)为菊科艾纳香属植物的干燥全草，又名假东风草，多见于云南和广西交接部，生于山草坡地或灌木丛中[1]，其味甘、温、无毒，具有活血散瘀、祛风除湿、利水作用，在广西民间有几百年的药用历史，常用于妇女经期提前、产后血崩、浮肿、骨痛、受凉腹痛、腹泻等多种妇科常见疾病的防治[2].以滇桂艾纳香为原料的乙醇溶液提取物制成的中成药——妇血康颗粒，已用于临床，疗效显著；研究表明，其水提取物也具有显著的止血活性功效[3-4]，但是其有效成分及其含量、药理作用均不是非常明确；因此，本文对其水提多糖(BlumearipariaPolysaccharides,abbreviated as BRP)成分进行提纯，并对多糖的组分进行分析[5-6]，为进一步研究妇血康颗粒制剂的药理和作用机制打下基础.

1 仪器与方法

1.1 材料与设备

滇桂艾纳香干燥全草，广西桂西制药有限公司；DEAE-纤维素，上海恒信化学试剂有限公司；Sephadex G-15和Sepharose 6FF 生化试剂，南京森贝伽生物科技公司；葡萄糖(AR),上海医药公司；果糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸(生化试剂),上海伯奥生物科技有限公司；RC-45-1k透析袋,上海绿岛科技发展有公司；硫酸、苯酚、无水乙醇、丙酮等均为国产AR试剂.

Nexus 470型FT-IR红外分光光谱仪(Nicole，America)；Agilent 1260高效液相色谱仪(America)；Agilent Technotgies 1200 GPC System(America);UV-265FW紫外可见分光光度计(Shimadzu Japan)；DZF60-20真空干燥箱(河南巩义科技仪器公司)；ALPHAL-型真空冷冻干燥机(Germany).

1.2 实验方法

1.2.1 滇桂艾纳香干燥全草多糖BRP的提取、分离、纯化

(1) 提取 取滇桂艾纳香干燥全草5 kg，粉碎，过282 μm筛，称其碎片3.0 kg，加无水乙醇回流提取多次，除去脂溶性成分，药渣以蒸馏水为溶剂，用微波提取器(1 kW,10 L)在85 ℃下提取3次，每次20 min；提取液离心去杂、减压浓缩约至原体积的1/5，加乙醇至含醇80%左右，冰浴放置过夜，离心，得BRP沉淀物.BRP用无水乙醇多次浸提，去除残余脂溶性物质和部分色素.

(2) 脱色 将上述BRP配成稀水溶液，直至沉淀物不再溶解，过滤，取滤液过D101大孔树脂，用水洗脱，直至洗脱液颜色浅淡，收集水洗脱液，浓缩[7].

(3) 分离 将上述浓缩液进行DEAE-纤维素柱层析[8-9]，依次用蒸馏水和0.15，0.30，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，用苯酚-硫酸显色检测，收集各梯度洗脱液.

(4) 脱蛋白 对各收集液采用Sevage法(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)多次脱蛋白至紫外260～280 nm处无明显吸收峰为止[10].

(5) 透析 脱蛋白后的BRP溶液装入G-RC-45-1k透析袋内，活水透析72 h以上.

(6) 脱盐 透析后的BRP溶液过Sephadex G-15柱层析，脱除BRP溶液中残留的盐，收集BRP溶液.

(7) 凝胶纯化 将透析的BRP-0和BRP-1.5溶液浓缩，过0.45 μm微孔滤膜，经琼脂糖凝胶Sepharose 6FF层析，蒸馏水洗脱，自动部分收集器收集，苯酚-硫酸显色检测，绘制洗脱曲线，根据峰型合并各洗脱部分，冷冻干燥，得BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4五个组分.

1.2.2 BRP性质表征

(1) BRP相对分子质量及分子质量分布测定 采用凝胶渗透色谱法，Agilent 1260HPLC仪，柱型为PL.Aqnagel-OH(300 mm×7.8 mm)，柱温，35 ℃；流动相：0.05 mol/L H3PO4-Na2HPO4缓冲液(pH6.7，加0.05%NaN3)；流速:1.0 mL/min；示差折光检测，进样体积20 μL；以T系列葡聚糖T-1，T-3，T-5，T-7，T-9，T-11和T-13为标样对照.

(2) BRP的酸水解 分别取50 mg BRP-0-1和BRP-1.5置于安培管中,加入6 mL 2 mol/L H2SO4，在油浴中保持110 ℃恒温加热8 h，水解液用BaCO3粉末中和除酸，离心，将上清液浓缩，定容至2 mL，供HPLC分析.

(3) BRP红外光谱分析 取微量BRP样品，拌KBr研磨压片，在4 000～400 cm-1波数范围内扫描检测基团吸收峰类型.

(4) BRP单糖组成分析 色谱条件：Kromasil NH2色谱柱(250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈-水(体积比为80∶20)；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min，示差折光检测；进样量：20 μL[11-12].

2 结果与分析

2.1 BRP蛋白含量检测

BRP经紫外光谱扫描检测,如图1所示，260～280 nm处几乎无紫外吸收峰，表明多糖中蛋白、多肽及核酸几乎脱除完全，达到分离纯化要求.

图1 BRP脱蛋白前后紫外光谱图Fig.1 UV spectra of not removed protein (a) and removed protein (b) on BRP

2.2 DEAE-纤维素对BRP的分离

BRP溶液经DEAE-纤维素层析柱分离，分别用蒸馏水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集部分分别命名BRP-0，BRP-1.5，BRP-3和BRP-4.5，其洗脱曲线见图2.由于BRP-3和BRP-4.5组分还含少量难除色素，所以只对BRP-0和BRP-1.5进一步分离纯化研究.

2.3 BRP-0进一步纯化

将BRP-0配成适当浓度溶液，经琼脂糖凝胶Sepharose 6FF柱层析纯化分离，蒸馏水洗脱，BRP-0的洗脱曲线如图3所示，所得多糖命名BRP-0-1.

图2 BRP在 DEAE-纤维素柱上的洗脱曲线Fig.2 Elution curve of BRP on DEAE-cellulose column

图3 BRP-0的Sepherose 6 FF层析洗脱曲线Fig.3 Elution curve of BRP-0 on Sepherose 6 FF column

2.4 BRP-1.5进一步纯化

将BRP-1.5上Sepharose 6 FF层析洗脱，得4个洗脱组分，分别命名为BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4，洗脱曲线如图4所示.

2.5 BRP纯化组分分子量及分子量分布测定

采用凝胶渗透色谱法(GPC 法)测定多糖BRP的相对分子质量(M)[13]，BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4各组分分子质量及分子质量分布测定和纯度如图5～6所示.

图4 BRP-1.5的Sepherose 6 FF层析洗脱曲线图Fig.4 Elution curve of BRP-1.5 on Sepherose 6 FF column

图5 多糖BRP-0-1的凝胶过滤色谱图Fig.5 HPGPC of BRP-0-1

图6 多糖BRP-1.5纯化组分的凝胶过滤色谱图Fig.6 HPGPC of BRP-1.5-1， BRP-1.5-2，BRP-1.5-3 and BRP-1.5-4

通过Agilent Technotgies 1200 GPC System检测BRP色谱图，得相对分子质量及分子质量分布参数如表1.

表1 BRP相对分子质量和分子质量分布参数

由表1可见，多糖组分BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4的重均相对分子质量分别为1 394，11 754，8 319，7 208和5 936，分散系数分别为1.035，1.053，1.099，1.091和1.081，这些组分均由单一色谱峰组成，峰型尖锐均匀对称，表明它们是均一组分多糖.

2.6 BRP的红外光谱图

图7 BRP的红外光谱图Fig.7 IR spectrum of BRP

基团类型波数/cm-1峰的强度键的振动类型O—H3418.83vsO—H伸缩振动C—H2920.56,2847.66mC—H伸缩振动C O1616.82sC O伸缩振动C—H1423.36wδas(C—H)(CH3,—CH2)面内弯曲振动C—O1070.09vsC—O伸缩振动

2.7 BRP-1.5的HPLC分析

HPLC对水解后的BRP多糖与单糖对照品对照，分析其单糖组成[15]，见图8～9所示.结果表明，BRP-0和BRP-1.5除含少量半乳糖醛酸外，主要由鼠李糖、果糖和半乳糖组成，其物质的量之比大致为：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

(1)半乳糖醛酸；(2)鼠李糖；(3)果糖；(4)半乳糖图8 BRP-0-1的HPLC 检测图Fig.8 HPLC chromatogram of BRP-0-1

(1)半乳糖醛酸；(2)鼠李糖；(3)果糖；(4)半乳糖图9 多糖BRP-1.5-3的HPLC色谱图Fig.9 HPLC chromatogram of BRP-1.5-3

3 结论

滇桂艾纳香干燥全草提取得粗多糖BRP，经DEAE-纤维素层析分离得到BRP-0，BRP-1.5，BRP-3和 BRP-4.5，进一步将BRP-0和BRP-1.5纯化后获得BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4组分，经HPGPC检测，它们为均一分子多糖，其重均相对分子质量分别为1 394，11 754，8 319，7 208和5 936，分散系数分别为1.035，1.053，1.099，1.091和1.081，说明其分子质量分布均一.通过HPLC分析，BRP-0和BRP-1.5主要由鼠李糖、果糖、半乳糖组成,其单糖物质的量之比大致为：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

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(编辑 WJ)

Extraction,Purification and Composition Analysis of Polysaccharides fromBlumeaRiparia

XUZi-jing1,LIUQian2*,SHUQun-wei1,ZHANGZhi-hong1

(1.Center of Natural Products,Guizhou University of Engineering Science,Bijie 551700,China；2.School of Chemical Engineering and Resource Recovery,Wuzhou University,Wuzhou 543002,China)

Polysaccharides BRP were extracted from dry grass ofBlumearipariaas raw materials with water as solvent.Four eluents,BRP-0,BRP-1.5,BRP-3 and BRP-4.5,were obtained from BRP by gradient elution with water,0.15 mol/L NaCl,0.3 mol/L NaCl,0.45 mol/L NaCl on DEAE-cellulose column after BRP being decolored on D101 macroporous resin column.BRP-0 and BRP-1.5 were deproteinized by using the Sevage method,and further purified by water dialysis and Sephadex G-15 chromatography to remove residual NaCl.Five portions of the elutent,BRP-0-1,BRP-1.5-1,BRP-1.5-2,BRP-1.5-3 and BRP-1.5-4.5,were obtained after the purification of BRP-0 and BRP-1.5 on agarose column chromatography Sepharose 6FF.Our results showed that they were homogeneous polysaccharides through GPC detection in molecular weight,molecular weight distribution,and GPC peak analysis.Our HPLC analysis results showed that both BRP-0 and BRP-1.5 mainly consisted of rhamnose,fructose,and galactose,whose molar mass ratios were about 1.00∶0.962∶0.392 and 1.00∶1.125∶0.584,respectively.

Polysaccharide fromBlumeariparia; DEAE-cellulose column separation; gel permeation chromatography purification; HPGPC detection; monosaccharide analysis

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.01.010

2016-09-01

贵州省科技厅、毕节市科技局学校联合基金资助项目(LH[2016]7059)；贵州省毕节市2016年科学发展计划基金资助项目([2016]32)

* 通讯作者,E-mail：wzliuxi1975@126.com

R284

A

1000-2537(2017)01-0065-06