中药多糖提取测量研究进展*

2017-02-28张蕊馨周迎春

黑龙江中医药 2017年2期

关键词：多糖中药含量

张蕊馨齐彦周迎春

（黑龙江中医药大学临床医学院·150040）

中药多糖提取测量研究进展*

张蕊馨齐彦**周迎春

（黑龙江中医药大学临床医学院·150040）

目的：对中药糖的研究进展进行综述。方法：查阅相关文献，对中药多糖提纯工艺、含量测定等方面进行总结。结果：中药多糖可用用合理的工艺提取，适宜的方法测定。结论：可为中药多糖的进一步开发研究提供科学依据。

中药多糖提纯工艺含量测定

多糖及糖复合物存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。因此，中药多糖在生命科学、药物研究中的研究意义深远。

1 中药多糖的提取、分离和纯化概述

1.1 提取工艺概述

多糖是极性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇。常用的方法有水提法、酸提法、碱提法、超声提法、微波提法等。

1.1.1 水提法提取多糖最常用的方法之一是用水来作溶剂。植物多糖采用热水浸提法提取较适宜，提取得到的溶液可直接分离不溶物，用浓度高的乙醇沉淀提纯亦可；还可以利用乙醇浓度的不同，分级分离多糖的不同组分。梁婷婷等[1]研究了水提醇沉提取太子参多糖的最佳工艺条件。虽然水提法不需特殊设备，成本低等，但费时且提取效率低。

1.1.2 酸提法对一些特定的植物多糖提取，用稀酸提取能获得更高的提取率。但为避免引起多糖中糖苷键的断裂，需严格控制酸度。孟宪元等[2]利用稀酸提取得纯度较高茜草多糖。

1.1.3 碱提法为了得到更高的提取率，可在碱液中提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。李平等[3]利用碱法提取山茱萸多糖，得褐色山茱萸粗多糖。但为避免有些多糖在碱性较强时发生水解,碱的浓度应合理控制。

1.1.4 超声提取法为了使提取的有效成分易于溶解于溶剂之中，可利用能产生“空化作用”及其次级效应的超声波，使生物细胞和组织易于破碎；这样可大大加速了萃取过程，有利于被提取成分的生物活性尽量保持不变。胡斌杰[4]等利用超声波法与传统热水法提取灵芝多糖。发现超声波法提取时间较传统热水法缩短3/4，而提取率高30%。

1.1.5 微波提取法不同的物质，微波吸收能力也不同，因此，吸收微波能力强的基体中某些物质，或萃取体系中的某种组分，会被加热，从基体或体系中分离出来，这是微波提取法的机制。刘青梅进行了紫菜多糖微波提取的影响因素研究。表明影响微波浸提的主要因素为浸提时间、微波功率和液固质量比。

1.1.6 生物酶解提取法生物酶的特点是具有高度专一性，若作为浸提辅助剂，有利于中药植物的细胞壁降解或水解，从而易于提取细胞内有效成分。但是，中药多糖用酶解法提取，对反应的温度以及pH值等参数的要求严苛，需预实验确定合理参数。张弛[5]等利用酶法技术提取板党多糖，以纤维素酶提取的最优工艺为：酶用量120U/g干粉、pH4.0、温度40℃、酶解时间150min，提取率为28.22%。

1.2 分离和纯化概述

1.2.1 多糖的分离（1）除蛋白质：游离蛋白质在多糖中的去除方法依据多糖的类型而异，对于微生物类多糖的分离常用Sevag法及三氟三氯乙烷法处理，对于植物类多糖分离的可用三氯醋酸法处理；而对于糖肽类，则需用酶破坏蛋白质与糖的结合再去除。

（2）除色素：多糖提取过程中常伴随氧化作用，会产生色素，而多糖的含量测定时，色谱分析的准确性会受到色素干扰。因此需要除去色素，常用方法有活性炭吸附法、离子交换法、氧化剂氧化法等。

（3）除小分子杂质：去除小分子杂质，常用超滤和透析的方法。若要将多糖样品按分子大小分级，可选用不同规格的超滤膜和透析袋进行，或一定条件下的超速离心操作来实现。

1.2.2 多糖的纯化（1）沉淀法：利用在不同浓度低级醇、酮中，多糖溶解度不同的性质，可以实现分级沉淀。李卷梅[6]等用乙醇分级沉淀法纯化香薷多糖。向多糖提物中依次加入6组体积分数分别为20%～70%的乙醇，纯化后得香薷多糖组分HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6，糖含量中等。

依据不同盐浓度中，不同多糖溶解度不同，而将多糖分离称盐析法。氯化钠、氯化钾、硫酸铵等常用作盐析剂,其中硫酸铵效果最佳。而对于各种不同酸性多糖，可通过控制季胺盐的浓度分离得到。何伟珍[7]等对用季铵盐沉淀法纯化银耳粗多糖。加2%CTAB溶液于提取液可得纯化产率37.4%的精品银耳多糖，且多糖含量由50.5%增加到76.28%。

常用斐林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等作络合剂与多糖形成金属络合物而沉淀分离，也是一种有效的方法。

（2）柱层析法：选择不同浓度的盐溶液和缓冲溶液，作为洗脱剂，采用葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶的柱层析法，可分离纯化大小不同的多糖分子。但处理粘多糖效果不佳。

为了处理各种酸性、中性多糖和粘多糖，可选择不同浓度碱型和硼砂型两种洗脱剂，采用DEAE-纤维素和ECTEOLA-纤维素的阴离子交换剂柱层析法，其过程中能够吸附杂质而达到部分纯化的效果。

（3）其他方法：若按多糖的电荷性质不同分级，可采用区域电泳法纯化多糖。聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳是比较常用的方法。

2 中药多糖含量测定概述

2.1 多糖测定方法

2.1.1 比色法目前苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法应用最广。多糖含量的比色测定法，其作用机制是多糖在浓硫酸的作用下先被水解成单糖，然后生成糖醛衍生物，再与苯酚或者葸酮缩合产生有色化合物。这里利用了吸收值与糖浓度存在的线性关系，在一定浓度范围内和适当波长下，可以通过比色测定其含量。梁丽军[8]等用蒽酮-硫酸法建立大蒜多糖的含量测定方法。

2.1.2 滴定法滴定法的作用机制是在酸性环境及适宜温度下，可以水解经乙醇沉淀分离后的多糖成单糖，然后使用次甲基蓝指示剂，对标定过的碱性酒石酸铜溶液进行滴定，测量样液体积的消耗量，以此计算其含量多少。该方法速度快,无需精密仪器，适用于所有多糖，但是，滴定法伴随着还原反应，还原糖会影响其结果。陈广东[9]等采用高锰酸钾滴定法快速测定肝速康胶囊中云芝多糖的含量。表明了高锰酸钾滴定法简单、准确、重现性好。

2.1.3 薄层色谱法薄层色谱是利用样品组分的差异与吸附剂之间的吸附力不同，而且其分配系数在展层溶剂中亦不相同，从而使混合物出现分离。薄层层析的特点是样品需要量较少，设备操作简便，分离效果好。王亚娟[10]等建立了双波长薄层扫描法测定乌灵胶囊中多糖含量的方法。结果显示该方法测定乌灵胶囊中多糖的含量，操作简便，重复性好，结果可靠。

2.1.4 高效液相色谱法（HPLC法) HPLC法既能测定样品中多糖的含量，也能测量分子量分布。HPLC作用机制是选用TSK、SW凝胶排斥色谱柱，以分子量不同的标准右旋糖酐作标准，在示差折光检测器中检测经简单预处理的样品。HPLC法具有诸多优点，如分析快速、选择性强、分离效能高、灵敏度高等。强静等[12]采用HPLCELSD法测定多糖的含量。其条件为：汉邦KromasilC18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相为(5:95)；流速0.8ml/min；检测器漂移管温度115℃；进样量20μl；分析时间5min。

2.1.5 气相色谱法(GC法) 若要既定性又定量分析多糖的组分及含量，就选用GC法。该方法的操作是先用盐酸-甲醇把多糖酸水解物或甲醇解物，再用三氟乙酰化(TFA)转化为乙酰化产物，或者三甲基硅烷基化(TMS)转化为硅烷化产物，然后用气相色谱分析处理。吴韶辉[12]等采用三氟乙酸水解豌豆根尖黏液中的多糖。使用气相色谱分离测定了衍生化后的6种单糖。

2.1.6 高效毛细管电泳(HPCE法) 近年来，人们开发了对多糖进行分析的高效毛细管电泳法，取得更好的效果。高现朝[13]等采用高效毛细管电泳法分析百合多糖的单糖组成。表明高效毛细管电泳法用于分析多糖的组成，精度高，操作方便。

此外，多糖分析还有其他方法可用。而且随着检测仪器愈来愈先进，多糖含量检测将变得更简便、快速、准确。常静[14]等利用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)对不同等级贵州灵芝的红外光谱进行了测定。结果表明可用红外光谱法来预测灵芝多糖含量。