SCN9A基因突变与癫痫的相关性

2017-02-28伍明刚李新宇左松林王菊丽朱金玲张金波

中国老年学杂志 2017年3期

关键词：钠离子基因突变癫痫

伍明刚张昭李新宇左松林王菊丽朱金玲张金波

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江佳木斯 154007)

SCN9A基因突变与癫痫的相关性

伍明刚张昭李新宇左松林王菊丽1朱金玲2张金波2

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江佳木斯 154007)

目的探讨SCN9A基因rs6746030位点与癫痫疾病发病的相关性。方法从医院随机选取中央颞区棘波儿童良性癫痫(BECT)组78例和原发性未分类癫痫组82例，以正常人(无癫痫发作史且家族其他上下三代亲属中无癫痫发作史)32例血液作为对照组，提取全血DNA，以PCR扩增、酶切、电泳、测序等技术确定碱基序列及基因分型。运用χ2检验计算该基因型与癫痫发病相关性。结果对照组与疾病组均为平衡群体(P>0.05)；SCN9A基因rs6746030位点与BECT癫痫发病存在相关性(P=0.006 3)；SCN9A基因rs6746030位点与未分类癫痫相关(P=0.012 0)。结论 SCN9A基因rs6746030位点突变与癫痫发病具有相关性。

癫痫；基因突变；SCN9A

癫痫是大脑神经元突发性异常放电导致短暂大脑功能障碍的一种慢性疾病。遗传学与生物学研究〔1，2〕表明，神经元细胞核中编码离子通道的基因突变导致膜通道蛋白改变引起通道性质与结构的变化与癫痫发病关系密切，其中包括SCN9A〔3〕参与编码的电压门控性钠离子通道蛋白〔4，5〕。钠离子通道的打开与关闭能控制细胞电流的变化，在调整大脑神经元放电过程中有主要作用。本文旨在探讨SCN9A与癫痫发病的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象经同意采取癫痫患者血液标本，选取从2012～2015年，佳木市中心医院中央区棘波儿童良性癫痫(BECT)组78例和未分类癫痫组82例，筛选正常人32例血液作为对照组不做性别统计。未分类癫痫组入选标准为在医院确诊为脑部异常放电引起癫痫的病人。 PCR引物设计：根据美国国立生物信息中心NCBI给予的rs6746030基因序列，由上海生工公司设计引物。引物序列：正向引物5′-GTGGTCCTTTGGACAACAGC-3′，反向引物5′-TGGTTGAGGGAGTATCACAGAA-3′，PCR扩增产物长为477 bp，经酶切以后所得酶切产物分别为144 bp和333 bp。

1.2 外周血DNA提取经DNA提取试剂盒(BioTeKe全血基因组提取试剂盒)提取DNA后保存于-20℃冰箱内。

1.3 PCR扩增反应体系为15 μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，72℃终末延伸5 min，循环30次。

1.4 酶切 rs6746030位点的酶切酶为FastDigest Csp6I，试剂添加为Csp6I 0.8 μl；缓冲液1.6 μl；三蒸水13.6 μl，将16 μl混合液混入8 μl DNA 产物中，37℃水浴5 min后80℃水浴灭活10 min。

1.5 琼脂糖凝胶电泳及测序 2%琼脂糖凝胶电泳，电压150 V，时间45 min，紫外线凝胶成像分析系统进行基因分型。随机选取不同基因型个体DNA标本寄送中国上海生物工程股份有限公司对其进行测序。

1.6 统计学方法采用SPSS11.0软件进行χ2检验。

2 结果

2.1 Hardy-Weinber平衡分析各实验组均满足Hardy-Weinberg平衡，P>0.5，所以选取的各组标本为遗传平衡群体，见表1。病例组与对照组间等位基因频率有统计学意义，见表2、表3。

2.2 SNP位点测序结果图和酶切凝胶电泳图

2.2.1 SNP位点测序结果图在所有结果中只见G/A与G/G两种基因型，未见A/A型突变，见图1。

2.2.2 酶切结果见图2。

表1 各组等位基因的Hardy-Weinberg遗传平衡检验(n)

自由度λ=2

表2 BECT组与对照组的rs6746030位点的基因型及等位基因频率分布比较〔n(%)〕

G/G为野生纯合子，G/A为突变杂合子，A/A为突变纯合子，下表同

表3 癫痫组与对照组的rs6746030位点的基因型及等位基因频率分布比较(%)

图1 SNP位点测序结果图

Y：原样；GG：野生纯合子G/G；GA：突变杂合子G/A；未见突变纯合子A/A型图2 酶切结果

3 讨论

癫痫是神经系统的常见病之一，癫痫的家族聚集现象显示其发病具有遗传性，与癫痫有关的基因已被准确定位〔6〕。癫痫发病可以分为原发性癫痫和继发性癫痫，其中继发性癫痫往往继发于脑部内外伤、神经系统寄生虫感染、脑血管病、肿瘤、遗传代谢、神经系统药物中毒等。原发性癫痫为脑部异常放电引起身体肌肉痫样痉挛，临床上诊断只能依靠询问病史、脑电图检查等，到目前为止未发现能对原发性癫痫发作有联系的实质性损伤。近年来研究表明，癫痫的发病与离子通道的改变有关〔7〕，染色体19q13.1的基因SCN1B(编码电压型门控钠离子通道的β1调节亚基)的点突变导致GEFS+，表明电压型门控钠离子通道的改变能诱发癫痫。电压性门控钠离子〔8〕通道蛋白中αⅠ、αⅡ、β1、β2、α9蛋白分别由SCN1A、SCN2A、SCN1B、SCN2B和SCN9A基因编码表达，其中SCN9A基因在GEFS+家族中的I62V、P149Q突变〔9〕，SCN9A突变还被发现与SCN1A突变共同存在于SMEI家族中，说明SCN9A基因突变能诱发癫痫，但SCN9A基因具体碱基的突变与癫痫发病相关性及该基因突变的致病机制研究报道很少。研究SCN9A基因突变与原发性癫痫之间相关性，可以丰富原发性癫痫病因学内容。

SCN9A基因在检测中未发现突变纯合子A/A的类型，可能

因为G突变为A的概率为0.109/237(GenBank数据)，突变率低，但是不排除纯在野生纯合子A/A型基因，故统计时每个基因组数据都加0.5后进行统计。SCN9A基因中rs6746030位点上野生纯合子G/G突变成杂合子A/G后可能引起BECT发病，G向A突变可能与BECT发病有关；同样的，SCN9A基因中rs6746030位点上野生纯合子G/G突变成杂合子A/G后可能引起大多数原发性癫痫发病，G向A突变可能与大多数原发性癫痫发病有关。

编码电压型门控钠离子通道蛋白基因突变诱发很多癫痫综合征，大多数〔10〕突变发生在SCN1A基因上，对SCN9A基因突变导致癫痫发病的报道少，本研究对SCN9A基因突变引发癫痫在病因学上做了补充，但是由于标本量小，标本采集地域局限，所以该研究只针对佳木斯地区有一定的意义，研究还待进一步深入，探索人类SCN9A基因与癫痫的关系。

1 李玉娟，柳垂亮，王飞，等.异氟醚和七氟醚对新生大鼠皮质凋亡以及Akt和Bcl-x/Bad表达的不同影响〔J〕.中山大学学报(医学科学版)，2011；32(3)：291-6.

2 Engel T，Henshall DC.Apoptosis，Bcl-2 family proteins and caspases：the ABCs of seizure-damage and epiletogenesis〔J〕?Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol，2009;1(2)：97-115.

3 孙贺东，资晓宏.SCN9A基因研究进展〔J〕.国际遗传学杂志，2009；32(1)：27-31.

4 向林，杨青.特发性癫痫离子通道基因的研究进展〔J〕.重庆医科大学学报，2007；32(1)：106-9.

5 Chang BS.Lowenstein dh epilepsy〔J〕.N Engl J Med，2003；349(13)：1257-66.

6 张鑫，谭启富，武建国.癫痫与基因〔J〕.立体定向和功能性神经外科杂志，1998；11(3)：56-8.

7 肖波，江利敏.癫痫的发病机制〔J〕.临床内科杂志，2004；21(9)：577-80.

8 陈程洁，周桃，云慧，等.电压门控钠离子通道疾病的研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2013；13(30)：5995-6000.

9 宋延民，龙莉莉.电压门控性钠离子通道与癫痫〔J〕.中华临床医师杂志(电子版)，2011；5(11)：3262-4.

10 刘超.SCN1A基因突变的致痫机制研究〔D〕.广州：广州医学院，2011.

〔2016-03-11修回〕

(编辑李相军)

2015年黑龙江省大学生创新创业训练计划指导项目(201510222043)；佳木斯大学创新团队项目(CXTDPY-201602)；佳木斯大学青年基金项目 (Sq2012-38)

张金波(1974-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事遗传病的诊断、治疗与预防研究。