慢病毒表达系统介导的RNAi技术靶向沉默Bi-1基因对鼻咽癌细胞生物学特性的影响

皮 文 于长华 刘志标

(淮安市第一人民医院耳鼻咽喉科，江苏 淮安 223300)

慢病毒表达系统介导的RNAi技术靶向沉默Bi-1基因对鼻咽癌细胞生物学特性的影响

皮 文 于长华1刘志标

(淮安市第一人民医院耳鼻咽喉科，江苏 淮安 223300)

目的 探讨Bi-1 基因的生物学功能及其与鼻咽癌发生与发展的相关性。方法 首先构建以Bi-1 为靶基因的RNA干扰(RNAi)质粒载体,采用慢病毒表达系统将其导入细胞，利用RNAi 技术在细胞内诱导特异序列的基因沉默以观察对鼻咽癌细胞生长增殖的影响。结果 靶向Bi-1 沉默的慢病毒感染鼻咽癌细胞后能有效抑制细胞的生长增殖并诱导其凋亡，在荧光显微镜下可见经靶向Bi-1沉默的慢病毒处理后的鼻咽癌细胞呈现出细胞皱缩、核固缩、核断裂等典型的凋亡细胞形态，而且DNA凝胶电泳图谱呈现“梯状”现象；此外，Bi-1 基因的沉默可有效地抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生长。结论 靶向沉默鼻咽癌细胞中的Bi-1表达，可抑制细胞生长增殖，并诱导细胞发生凋亡。

鼻咽癌；Bi-1；RNA干扰；慢病毒

细胞凋亡是由基因编程控制的一种细胞生理性死亡，是多细胞生物体维持正常生长、组织动态平衡等正常生理活动的需要〔1〕。细胞凋亡涉及体内代谢的多个分子、多条途径，因此其发生机制和影响因素复杂多样，迄今其机制并未完全清楚。Bi-1 基因作为细胞内的凋亡抑制基因，已被发现其在体内组织的表达随着组织的发展而发生改变，说明Bi-1 基因的表达可能与细胞生长增殖密切相关〔2〕。本研究拟探讨Bi-1 基因与鼻咽癌细胞发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株、菌株和质粒：人鼻咽癌细胞株CNE-1、SUNE-1 和病毒包装细胞293T 均由广东医学院生物化学与分子生物学研究所保存，大肠杆菌E.coli XL-blue 为本研究所保存。慢病毒包装系统包括一个转移载体pLUNIG 和三个包装载体pMDL-G/p-RRE，pRSV-REV 和pMK-VSVG。

主要试剂：Bi-1 山羊IgG 多克隆抗体，β-actin小鼠IgG 单克隆抗体，山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)，兔抗山羊IgG-HRP；ECL 试剂(Santa Cruz)；SS-PAGE 低分子量标准蛋白质(BIO-RAD)；琼脂糖(Amresco)；PrimeScriptTMRT试剂盒Kit，SYBRR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR 试剂盒，限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ和CalⅠ，T4 DNA 连接酶(TaKaRa)；100 bp DNA marker，4，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)，聚偏氟丙烯(PVDF)膜(Sigma)；质粒抽提试剂盒(Giagen)；DNA ladder 检测试剂盒(Merck)；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染鼻咽癌细胞 将含有Bi-1 干扰片段的慢病毒(lenti-shBi-1)和对照慢病毒(lenti-shLuc)分别感染CNE-1 和SUNE-1细胞。具体操作：按病毒滴度，在一个1.5 ml EP 管中加入适量的转染病毒，并用培养基补充为100 μl后加入1 μl 100倍聚凝胺混匀，置室温孵育5 min，加入到24孔板中培养的鼻咽癌细胞中；同时加入培养基(200 μl)与100倍聚凝胺(2 μl)的混合液，轻轻混匀后于37℃、5%CO2培养箱培养过夜，次日更换为新鲜培养基后继续培养，感染48 h后荧光显微镜下观察荧光，并通过荧光细胞数推算病毒感染效率。

1.2.2 荧光定量 RT-PCR鉴定病毒感染鼻咽癌细胞中Bi-1的表达 具体实验步骤严格按照试剂盒说明进行，相对定量实验使用的分析方法为比较Ct值法。

1.2.3 Western印迹法鉴定病毒感染鼻咽癌细胞中Bi-1蛋白的表达 分别用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc慢病毒感染2种鼻咽癌细胞株CNE-1和SUNE-1，感毒感染12 h后更换新鲜培养基，继续培养60 h 后收集细胞，以预冷至0℃的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)洗涤2次，具体实验步骤严格按照试剂盒说明进行，用Leica QWin图像分析软件进行光密度积分值(IOD)分析。每个图像均重复分析3 次，取平均值。

1.2.4 噻唑蓝比色实验(MTT法)检测细胞增殖能力 感染后，每孔1×103个细胞接种于96 孔培养板中，每孔体积200 μl，每组做5 个平行孔，同时设空白对照(仅加培养基)，分别培养24、48、72、96、120 h 后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)后于37℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h，再加入150 μl/孔的DMSO，室温孵育10 min，脱色摇床上振荡10 min，置酶标仪上于490 nm处测定各孔吸光度值(A490 nm)。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.5 DAPI荧光染色法检测细胞形态学改变 分别用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc慢病毒感染鼻咽癌细胞CNE-1 和SUNE-1 72 h后，尽可能弃去上清，用胰酶消化后，800 r/min 离心5 min收集细胞，用适量的75%乙醇进行固定，4℃固定10 min，吸取1滴加到载玻片上，加入1.0 μl的DAPI 染料，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察细胞形态改变以区分出正常细胞与凋亡细胞并拍照。

1.2.6 凋亡细胞DNA ladder检测 分别收集用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc 慢病毒感染72 h后的鼻咽癌细胞CNE-1 和SUNE-1，按照Merck公司的DNA ladder检测试剂盒提取细胞DNA，具体实验按说明书操作进行。

2 结 果

2.1 重组质粒 pU6-Bi-1-shRNA的PCR鉴定 经PCR扩增后，阳性克隆得到一条较对照组大82 bp的条带，pU6-Bi-1-shRNA重组质粒成功构建。见图1。

M:100 bp marker;1:阳性单克隆;2:pU6图1 pU6-BI-1-shRNA重组质粒的 PCR鉴定

2.2 靶向 Bi-1沉默的慢病毒成功包装 将含靶基因shRNA 的慢病毒转移载体LunIG 与3 个病毒包装载体pMDL-G/p-RRE、pRSV-REV 和pMK-VSVG 混匀并转染293T 细胞后，可包装产生两种慢病毒，即含Bi-1shRNA 序列的慢病毒(lenti-shBi-1)和对照慢病毒(lenti-shLuc)。293T 细胞包装产生的慢病毒，经梯度稀释法测定得到病毒滴度。测定结果显示，lenti-shBi-1 慢病毒的滴度为6.5×105TU/ml，对照组慢病毒(lenti-shLuc)滴度为4.3×106TU/ml，两种病毒的滴度均能满足实验的需要。

2.3 慢病毒 lentivirus-shBi-1可明显抑制鼻咽癌细胞 Bi-1的表达 将包装产生的慢病毒颗粒lentivirus-shBi-1 分别感染CNE-1 和SUNE-1 细胞48 h后，荧光显微镜下观察到大多数细胞发出绿色荧光，结合可见光下的细胞总数，推算出病毒的转染效率高达90%以上。荧光定量PCR结果显示，用慢病毒颗粒lentivirus-shBi-1 分别感染CNE-1 和SUNE-1 细胞后，细胞中Bi-1 mRNA表达水平(0.048±0.014,0.092±0.010)显著降低，与未处理组细胞(设为1)相比差异显著(P<0.01)；而用慢病毒颗粒lentivirus shLuc 感染的细胞中Bi-1 mRNA 表达水平(1.063±0.044，1.063±0.044)与未处理组细胞相比基本上趋于一致，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 慢病毒感染后发绿色荧光的 CNE-1细胞(×100)

Western印迹检测结果显示，慢病毒颗粒lentivirus-shBi-1 分别感染鼻咽癌细胞CNE-1 和SUNE-1 72h后，细胞中Bi-1 的蛋白表达水平(0.108，0.167)显著降低，与未处理组细胞(1.061，1.032)相比差异显著(P<0.01)。而用慢病毒颗粒lentivirus-shLuc感染鼻咽癌细胞后，细胞中Bi-1 蛋白表达(0.998，1.087)与未处理组细胞相比没有明显改变。同时，根据各条带的Bi-1 蛋白灰度值与β-actin 蛋白灰度值比率，可计算出lentivirus-shBi-1 感染的CNE-1 和SUNE-1 细胞中Bi-1 的表达率分别为10.2%和16.2%，与对照组相比差异显著(P<0.01)。说明慢病毒介导的siRNA(lentivirus-shBi-1)可以明显抑制细胞中Bi-1 的表达，结果与荧光定量PCR的结果一致。见图3。

1:CNE-1;2:CNE-1-shLuc;3:CNE-1-shBi-1;4:SUNE-1;5:SUNE-1-shLuc;6:SUNE-1-shBi-1图3 Western印迹法检测鼻咽癌细胞 CNE-1及SUNE-1中 Bi-1蛋白的表达

2.4 Bi-1 基因沉默可抑制鼻咽癌细胞 CNE-1和 SUNE-1的生长增殖 分别用不同病毒感染鼻咽癌CNE-1 和SUNE-1 后，不同处理的三组细胞的体外增殖能力差异显著(P<0.01)。与未处理组细胞和lentivirus-shLuc 慢病毒处理组细胞相比，慢病毒lentivirus-shBi-1 处理的细胞生长增殖速度显著减慢，表明干扰Bi-1 基因表达后抑制了鼻咽癌细胞CNE-1 和SUNE-1 的体外增殖。见表1。

表1 lentivirus-shBi-1体外抑制鼻咽癌细胞的生长增殖

2.5 Bi-1 基因沉默可抑制鼻咽癌细胞 CNE-1和 SUNE-1凋亡 DAPI 细胞荧光染色结果显示：分别用慢病毒lentivirus-shBi-1 感染CNE-1和SUNE-1 细胞后，在荧光显微镜下可观察到细胞出现典型的凋亡形态学改变，包括胞体缩小、核固缩、核碎裂。而lentivirus-shLuc 慢病毒处理的鼻咽癌细胞中未见凋亡细胞的产生。DNA ladder 实验结果显示，慢病毒lentivirus-shBi-1 感染CNE-1 和SUNE-1 细胞72 h后，在琼脂糖凝胶电泳图片上呈现出较明显的“梯状”条带；但与DAPI 染色一样，用lentivirus- shLuc 慢病毒处理的鼻咽癌细胞中未见DNA“梯状”条带的出现。见图4，图5。

图4 DAPI 细胞荧光染色结果(×200)

图5 琼脂糖凝胶电泳结果

3 讨 论

基因治疗是通过引入遗传物质到特定的组织或细胞从而达到疾病治疗的一种实验性处理方法〔3〕。RNAi是一种定向基因沉默技术，属于转录后基因沉默机制〔4〕，它由双链RNA 启动，降解与双链RNA 具有相同序列的同源mRNA，进而高效、特异地阻抑细胞内源或外源性靶基因的表达，引起基因沉默。近几年的研究发现，长度为21～23 nt的siRNA 能引起特异性基因沉默，又不影响体内其他非目的基因的表达〔5〕。目前，RNAi 作为一种成熟的基因沉默技术已被广泛地运用到科研实践中，并取得了较好的基因沉默效果〔6〕。赵景宏等〔7〕利用RNAi技术成功地抑制了胰腺癌细胞中stathmin 基因而抑制了肿瘤细胞的生长，其抑制的特异性和效率都高达90%以上。还有研究发现，RNAi 在抑制Ⅰ型胰岛素样生长因子BP7(IGFBP7)基因表达时，能快速且特异地诱导恶性黑色素瘤细胞凋亡〔8〕。这些都说明采用RNAi 技术封闭癌基因在诱导某些癌细胞凋亡、抑制其复发和远处转移方面发挥至关重要的作用。

细胞的增殖、分化和凋亡之间的平衡是组织稳定性的先决条件，如果细胞凋亡受抑，细胞增殖与凋亡的平衡调节被破坏，结果导致细胞数目不断增加，表现出生长优势。Bi-1 作为细胞凋亡通路上受Bcl-2和Bax 调控的调节蛋白，在恶性肿瘤中，其过度表达或表达不足导致Bi-1/Bcl-XL/Bcl-2 和Bax 蛋白失去平衡，引起凋亡不足，细胞增殖与凋亡的平衡调节被破坏，与肿瘤的发生密切相关，而且可影响肿瘤的恶性行为如浸润、转移、恶性生长。虽然Bi-1 在动物的睾丸、肺、前列腺、心脏、脑、胎盘、肝、骨骼肌、脾、肾和胰腺等组织中广泛表达，但是与相应的正常细胞相比，Bi-1基因在前列腺癌、原发性乳腺癌细胞中的表达上调4～10倍。另外，在子宫癌、卵巢癌、胃癌和肺腺癌细胞中也发现Bi-1 基因表达的上调，这些表明Bi-1基因过表达可能与多种肿瘤的发生发展密切相关，有望成为肿瘤治疗的新靶点。然而，Bi-1 与其他肿瘤的关系尚未见报道，还需要进行深入的研究。进一步的研究还发现，当某些癌细胞(如乳腺癌、鼻咽癌)中高表达的Bi-1 基因被特异性地沉默后能抑制其生长增殖并诱导细胞发生凋亡甚至死亡，这就提示Bi-1 基因在肿瘤的基因治疗中可能有着重要的意义〔9〕。

本研究选取Bi-1 基因明显高表达的鼻咽癌细胞株CNE-1 和SUNE-1 为靶细胞，以复制缺陷型慢病毒作为载体，首先成功构建可特异性沉默Bi-1 基因表达并带有GFP 报告基因的慢病毒载体LunIG-Bi-1-shRNA，并得到了较高滴度的慢病毒lenti-shBi-1。重组病毒颗粒感染两种鼻咽癌细胞后，经荧光定量PCR 和Western印迹验证可明显抑制细胞中Bi-1 基因的表达，抑制率可达85%以上，这为进一步研究Bi-1 基因在鼻咽癌发生发展中可能的作用提供了有效工具。

1 罗海清,李祥勇,蔡宏华,等.奈达铂联合 BI-1基因沉默对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.齐齐哈尔医学院学报,2015;36(10):1416-8.

2 王会敏,何柯新,徐建华,等.利用 RNAi阻抑 hTERT 和Bi-1双基因表达的RNAi作用效果的研究〔J〕.重庆医学,2015；44(8):1012-6.

3 李桂源，刘华英，周 鸣,等.鼻咽癌癌变的分子机理〔J〕.生物化学与生物物理进展，2006;33(10):922-31.

4 宗永生,吴秋良,林素暇,等.Eb 病毒相关性疾病病理学研究的进展〔J〕.中山大学学报:医学科学版,2005;26(5):481-7.

5 张美红,李祥勇,周克元,等.bi-1 短发夹状RNA 重组真核表达质粒对鼻咽癌细胞和卵巢癌增殖的影响〔J〕.肿瘤防治研究,2008;35(5):321-4.

6 Yuan JS,Reed A,Chen F,etal.Statistical analysis of real-time PCR data〔J〕.BMC Bioinformatics,2006;7(1):85-96.

7 赵景宏,黄 岚,晋 军,等.造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡的caspase-3 机制〔J〕.中国药理学通报,2006;22(9):1111-4.

8 Hannon GJ.RNA interference〔J〕.Nature,2002;418(6894)：244-51.

9 Chou MI,Hsieh YF,Wang M,etal.In vitro and in vivo targeted delivery of IL-10 interfering RNA by JC virus-like particles〔J〕.J Biomed Sci,2010;24(1):17-51.

〔2016-01-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

皮 文(1966-)，女，副主任医师，主要从事耳鼻咽喉肿瘤临床诊治研究。

R76

A

1005-9202(2017)03-0555-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.014

1 淮安市第一人民医院放疗科