参苓白术散治疗大鼠脾虚湿困型溃疡性结肠炎的机制

周 华 张 敏 李 华 张 晟 张 平 姜文涛

(安徽医学高等专科学校生理教研室，安徽 合肥 230601)

参苓白术散治疗大鼠脾虚湿困型溃疡性结肠炎的机制

周 华 张 敏 李 华 张 晟 张 平 姜文涛

(安徽医学高等专科学校生理教研室，安徽 合肥 230601)

目的 探讨参苓白术散对脾虚湿困型溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠平滑肌细胞上钙池调控的钙离子通道(SOC)介导的Ca2+内流变化的影响及可能机制。方法 64只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、柳氮磺吡啶组、参苓白术散组， 每组16只。首先复制脾虚湿困型UC大鼠模型；采用fura-2荧光测定各组细胞外Ca2+内流的变化；用生物信号采集系统记录各组结肠平滑肌收缩张力的变化；用免疫组织化学的方法观察各组结肠平滑肌上瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)1蛋白质表达情况。结果 ①在无钙4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中，模型组〔Ca2+〕i低于正常对照组(P<0.05)。在引入两种不同的含钙HEPES缓冲液后，模型组低于正常对照组(P<0.05)，而柳氮磺吡啶组与参苓白术散组均高于模型组(P<0.05)。②模型组结肠平滑肌张力低于正常对照组(P<0.05)，而柳氮磺吡啶组与参苓白术散组张力高于模型组(P<0.05)。③各组结肠平滑肌上均有TRPC1细胞表达，其中模型组结肠组织TRPC1表达的平均光密度低于正常对照组(P<0.05)，而柳氮磺嘧啶组和参苓白术散组高于模型组(P<0.05)。结论 参苓白术散通过促进SOC介导的Ca2+内流治疗脾虚湿困型UC，其分子实质是上调TRPC1的表达。

参苓白术散；钙通道；脾虚湿困；溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎(UC)主要侵及结肠黏膜，是一种慢性非特异性炎性疾病，多首发于左半结肠，常呈进行性加重累及结肠近端及全结肠〔1〕。目前西医对于本病的治疗，一般多采取以水杨酸类药物、激素、免疫抑制剂等为主的药物治疗〔2〕。由于作用局限，毒副作用大，病人难以坚持治疗。国内多采用中医药进行干预〔3〕。中医治疗常采用参苓白术散，具有健脾渗湿之效，取得了良好的效果。研究证实，在结肠平滑肌上钙池调控钙离子通道(SOC)有瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)1的表达〔4〕。本研究探讨参苓白术散对脾虚湿困型UC大鼠结肠平滑肌中SOC介导Ca2+内流变化的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康清洁级Wistar大鼠64只， 雌雄均可，体质量(210±20)g，随机分为正常对照组、模型组、柳氮磺吡啶组、参苓白术散组，每组 16只，室温控制 在18℃～25℃， 大鼠适应性常规喂养3 d。参苓白术散水煎液组方严格按照《药典》执行；柳氮磺吡啶肠溶片购自上海信谊嘉华药业有限公司。 主要试剂和仪器：TRPC1 IgG兔抗人多克隆抗体(美国生物科技公司)、二抗试剂盒PV-6000 (北京欣兴唐生物科技有限公司)、恒温干燥箱(上海火诺电炉设备有限公司)、电子天平(常州市宏衡电子仪器厂)、生物信号采集系统(安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司)。960MC-荧光分光光度计(上海现科分光仪器有限公司) 。

1.2 脾虚湿困型UC大鼠模型制备 借鉴环境与饮食干预联合2，4，6-三硝基苯磺酸钠(TNBS)/乙醇灌肠法,每天保证大鼠在2 cm深的水中和有效睡眠时间均为8 h。单双日不规律饮食，造成脾胃功能失调。如单日禁食, 只灌服4℃生理盐水2 ml，双日则保证充足饲料供给，并灌服4 ml猪油，此种干预方式连续3 w。 在最后1 d,大鼠禁食不禁水, 用10%水合氯醛麻醉,然后将TNBS与乙醇混合物注入肛门上段, 随即将大鼠头部向下持续倒置约60 s，保证溶液进入大鼠肠腔内,待自然清醒后自由饮食。

1.3 干预措施 正常对照组：常规饲养，每日灌胃生理盐水2 ml。并参照造模方法给予肛门灌肠相同剂量的生理盐水。 模型组：常规饲养，每日灌胃生理盐水2 ml。参苓白术散组：参苓白术散煎剂灌胃，剂量为12 g·kg-1·d-1。柳氮磺吡啶组：柳氮磺吡啶灌胃，剂量为0.5 g·kg-1·d-1,均连续14 d。

1.4 平滑肌〔Ca2+〕i的变化 采用酶解法并结合密度离心法分离4组(每组选6只)结肠平滑肌细胞(SMC),制备新鲜结肠SMC悬液，通过锥虫蓝排斥试验，证明细胞成活率≥90%。标记fura-2荧光染料后，将细胞悬液分别置于无钙4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中，并分别向其中加入1 μmol/L毒胡萝卜内酯sigargin预处理30 min，然后再引入浓度分别为1.5和3.0 mmol/L的含钙HEPES缓冲液，从而引起的细胞内Ca2+上升被认为是SOC功能的一个指标，定义为〔Ca2+〕i。

1.5 结肠平滑肌收缩张力的变化 每组6只大鼠击头致昏后，立即进行解剖，暴露腹腔后，在距肛门约5 cm处采集一段约2 cm的结肠，放入4℃Krebs液中，并持续通入混有95%O2和5% CO2的气体。去除肠管黏膜层后沿纵向肌制备成规格为10 mm×5 mm的肌条标本，两端用手术线扎牢后将其置入含有37℃ Krebs 液的恒温浴槽中，用95% O2和5% CO2混合气体饱和。标本两端分别固定在浴槽底部和张力换能器上。收缩张力信号通过后者与生理记录仪相连，并通过电脑显示出来。标本前负荷为0.5 g，每20 min换液一次，平衡1 h后，将结肠平滑肌条置于无钙Krebs溶液中，并分别用1 μmol/L毒胡萝卜内酯预处理35 min，然后再加入含2.5 mmol钙Krebs溶液，所引起的张力幅度的明显增加，即由SOC介导的Ca2+内流所致。

1.6 结肠平滑肌TRPC1蛋白质表达情况 每组处死4只大鼠，开腹，截取距大鼠肛门约5 cm处的结肠组织，然后放入10%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后切成约5 μm 的组织薄片，常规脱蜡，采用非生物素二步法免疫组化检测试剂盒(PV6001)测定TRPC1蛋白的表达。分别滴加一抗和二抗，其中一抗浓缩型TPRC1 IgG兔抗人多克隆抗体工作浓度为1∶300,二抗采取的是通用型二抗PV-6000，显色后脱水、封片，用光镜观察，采集图像，并计算每100个细胞中的平均光密度。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行多组间单向方差分析，两两比较LSD-t检验。

2 结 果

2.1 各组平滑肌〔Ca2+〕i的变化 在无钙HEPES缓冲液中，模型组〔Ca2+〕i明显较正常对照组低。在引入两种不同的含钙HEPES缓冲液后，各组〔Ca2+〕i均有所增加，与正常对照组相比，模型组较低(P<0.05)。与模型组相比，柳氮磺吡啶组与参苓白术散组较高(P<0.05)。柳氮磺吡啶组与参苓白术散无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组不同缓冲液中平滑肌〔Ca2+〕i的变化

组别无钙HEPES含钙HEPES(1.5mmol/L)含钙HEPES(3.0mmol/L)正常对照组269.34±5.45403.32±9.671002.55±7.65模型组150.54±2.121)368.34±12.231)723.33±6.651)柳氮磺吡啶组265.23±12.542)398.34±8.572)993.65±5.602)参苓白术散组268.32±10.432)405.45±9.592)998.65±5.602)

与正常对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 各组结肠平滑肌收缩张力的变化 模型组结肠平滑肌张力〔(40.22±23.31)mN/mm2〕比正常对照组〔(90.01±12.35)mN/mm2〕低(P<0.05);柳氮磺吡啶组〔(88.23±19.34)mN/mm2〕与参苓白术散组〔(89.83±17.54)mN/mm2〕较模型组高(P<0.05)。

2.3 各组结肠平滑肌TRPC1蛋白表达情况 结肠平滑肌中TRPC1的阳性细胞多表达于细胞核或细胞质内，多呈棕黄色或褐色表达。模型组结肠组织TRPC1表达的平均观密度较正常对照组低(P<0.05)，柳氮磺嘧啶组和参苓白术散组比模型组高(P<0.05)。见图1和表2。

图1 各组结肠平滑肌TRPC1蛋白表达(SP，×400)表2 各组结肠平滑肌TRPC1蛋白表达平均 光密度比较

组别阳性细胞数平均光密度正常对照组21.45±4.670.791±0.079模型组12.34±5.231)0.412±0.0251)柳氮磺吡啶组19.34±5.242)0.785±0.0842)参苓白术散组18.57±2.592)0.779±0.0752)

3 讨 论

UC一般以慢性复发型居多，病变大多局限，经治疗预后较好。小于20岁或超过60岁的患者由于病情症状较重，病变范围广，若不及时治疗，具有极高的致死率〔5〕。然而，UC的临床症状并不典型，常错过最佳治疗时机，且病程超过10年以上者，具有极高的癌变可能〔6〕。关于的UC的发病机制尚未阐明，目前认为其与感染、免疫、遗传等因素有关，治疗上多采用消炎、免疫抑制等疗法〔7〕。中医学里并无UC一说，本病在中医领域属于“大瘕泄”范畴〔8〕，目前临床分型尚无统一标准，多认为脾虚湿盛为本病的发病关键，所以治疗上也以健脾渗湿为主则〔9〕。钙通道参与大鼠远端结肠平滑肌收缩〔10〕。UC发病时肠道动力紊乱与SOC介导的Ca2+内流下降有一定的相关性。在结肠平滑肌细胞上，胞内钙库耗竭后才可激活细胞膜上两种Ca2+通道〔11〕，即L-型Ca2+通道和SOC。为排除L-型Ca2+通道对本文结果的干扰，把新鲜结肠平滑肌细胞悬液分别置于无钙HEPES缓冲液中，并分别预处理后再引入含钙HEPES缓冲液，导致的细胞内Ca2+上升即被认为是反映SOC通道功能的一个指标。本实验提示脾虚湿盛型UC大鼠的结肠平滑肌收缩力下降的确与SOC介导的Ca2+内流减少有关。本文再次佐证钙通道参与大鼠远端结肠平滑肌收缩。由SOC介导的Ca2+内流是胃肠道平滑肌对许多激素或递质生理反应的一部分〔12～14〕，平滑肌收缩性下降可能与SOC功能低下有关。通过调节细胞内Ca2+浓度可以治疗炎症性肠病所致的黏膜出血，并愈合黏膜表面创口〔15〕。Yang等〔16〕探讨TRPA1 通道是否参与冷刺激引起的大鼠结肠平滑肌收缩及其可能机制，通过逆转录聚合酶链反应发现在大鼠升结肠和降结肠的平滑肌层均有TRPA1的mRNA表达。本文结果提示脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织TPRC1表达明显减弱，而经过柳氮磺嘧啶和参苓白术散治疗可显著增强其TRPC1的表达水平。

综上，脾虚湿盛型UC大鼠的结肠平滑肌收缩力下降与SOC通道介导的Ca2+内流减少有关，其分子实质是TRPC1的下调。而参苓白术散可能上调TRPC1的表达水平。

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〔2015-07-19修回〕

(编辑 苑云杰)

安徽省优秀青年人才基金重点项目(No.2013SQRL118ZD)

周 华(1979-)，女，硕士，讲师，主要从事消化道生理与药理研究。

R965

A

1005-9202(2017)03-0547-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.011