正交设计优化浊点萃取—光度法测定野生食用菌中的铜

张水花+毕春丽+付延英

摘要：探讨了以二乙基氨基二硫代甲酸钠为络合剂，非离子表面活性剂TritonX-100为萃取剂，测定4种食用野生菌中铜含量的浊点萃取-光度法联用的新方法。在单因素试验基础上，采用L16（45）优化萃取条件，详细探讨溶液的pH值、络合剂和非离子表面活性剂的用量、萃取温度和时间对浊点萃取效率的影响。在最优条件下，铜的线性范围0.0～0.5 μg/mL，线性回归方程为D=0.130 6C+0.000 43（r=0.999 1），检出限为0.48 μg/mL（n=11），相对标准偏差RSD<3.4%（n=5），样品加标回收率在99.26%～101.15%。该方法操作简单、环保、分析速度快、结果准确，将该方法用于4种野生菌中铜含量测定，结果令人满意。

关键词：浊点萃取；野生菌；分光光度法；铜

中图分类号： TS207.5+1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0186-03

云南省野生食用菌资源丰富，产量占全世界食用菌一半以上，占中国食用菌的2/3。食用野生菌常常含有利于人类身体健康的物质，在改善人类身体亚健康、防止重大疾病的发生方面起着重要的作用[1-2]，如荞面菌的子实体提取物对小白鼠肉瘤180及艾氏癌的抑制率为90%，奶浆菌有健胃、止咳平喘、祛痰等功效。此外，野生菌还具有味道鲜美的特点，备受人们喜爱。近年来，国内外学者偏重于研究野生菌抗氧化清除自由基延缓衰老、免疫调节、抗肿瘤、降血脂的作用[3-5]，但野生菌中的微量元素可通过与蛋白质和其他有机基团结合，形成酶、激素、维生素等生物大分子，发挥着重要的生理生化功能，而到目前为止关于野生菌中的微量元素研究却鲜见报道。因此，野生菌中微量元素的研究不可忽视，该研究不仅可以确定其营养水平，还能为野生菌进一步开发和应用奠定化学基础。食品中铜含量测定的现行国家标准方法有原子吸收光谱法和二乙基氨基二硫代甲酸钠分光光度法。但运行成本低、操作简单的二乙基氨基二硫代甲酸钠分光光度法在操作中使用了四氯化碳有機溶剂，对人体的身体健康有害，对环境也不友好。因此，对食品中铜含量测定新方法的研究不容忽视。浊点萃取法是近年来出现的一种新型环保的液-液萃取技术，目前在微量、痕量及复杂样品的分类分析中已有研究并取得了满意的结果[6-9]，但用于萃取并测定食用野生菌中微量铜的研究尚未见报道。本研究探讨了以二乙基氨基二硫代甲酸钠为络合显色剂，非离子表面活性剂TritonX-100为萃取剂的浊点萃取-分光光度法测定野生食用荞面菌、奶浆菌、红蜡蘑、铜绿菌中微量铜的可行性，在单因素试验的基础上采用正交法优化萃取测定试验条件，并将最佳条件下测定的结果与国标方法测定的结果进行对比。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

新鲜的奶浆菌、铜绿菌、红蜡蘑、荞面菌均购自云南省曲靖市当地农贸市场，将块菌洗净，低温干燥再在105 ℃下烘干后粉碎并过40目筛，得到干燥菌粉备用。

硫酸铜，二乙基二硫代氨基甲酸钠，TritonX-100，盐酸，氢氧化钠，硝酸，氨水，氯化铵，以上试剂均为分析纯。所有玻璃仪器在使用前均用稀硝酸浸泡，实验室用水为二次蒸馏水。

UV-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；pHS-3C精密酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司）；HH-306型恒温水浴锅（乐清市姚奥特仪表有限公司）；TDL-5-A低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 浊点萃取测定方法 准确移取一定量的试样于 10 mL 的具塞刻度离心管中，分别依次加入4 mL氨-氯化铵缓冲液，1.5 mL 0.4%二乙基二硫代氨基甲酸钠，2.0 mL 10% TritonX-100，加水稀释至刻度，恒温水浴一定时间后以 4 000 r/min 离心分离，分相后冰水浴5 min移去水相层，用二次蒸馏水稀释富胶束相定容至3 mL，静止后用紫外分光光度计在440 nm处测定其吸光度值。

1.2.2 样品预处理 采用GB/T5009.13—2003中的试样处理方法对样品进行处理，准确称取约5 g（精确到0.000 1 g）菌粉样品于瓷坩埚中，加5 mL硝酸放置0.5 h后小火蒸干，继续加热炭化，移入马弗炉中，500 ℃灰化1 h，取出冷却，再加入1 mL硝酸浸湿灰分，小火蒸干，再移入马弗炉中，500 ℃灰化0.5 h，冷却后取出用1 ∶1的硝酸溶解灰样，并转入 100 mL 容量瓶中用二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用（同时做空白试验）。

1.2.3 试验研究方法 考察试验过程中溶液的酸度、萃取平衡时间、平衡温度、Triton X-100用量、络合剂用量等5个因素对测定效果的影响，然后在单因素试验基础上，采用正交试验L16（45）设计方法优化测定方法，试验因素及水平见表1，试验方案及数据处理见表2，试验数据方差分析结果见表3。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

按照试验方法以试剂空白为参比，在360～600 nm波长范围内扫描得到铜络合物的吸收光谱（图1），选择最大吸收波长为440 nm为测定波长。

2.2 单因素试验

2.2.1 pH值对萃取效果的影响 络合剂二乙基氨基二硫代甲酸钠的稳定性与溶液酸度密切相关，酸性条件下，二乙基氨基二硫代甲酸钠易分解为二硫化碳，而碱性条件下又容易水解，因此，体系的酸度直接影响着络合反应的顺利进行及萃取效率。本试验考察不同pH值对铜萃取率的影响，发现随着pH值的增大，萃取效果先增大后减小，溶液酸度pH值为 8.0～9.0时，对铜的萃取效果最好（图2）。

2.2.2 平衡时间和温度对萃取效果的影响 通常来讲，较高的温度有利于反应快速达到平衡，但过高的温度又会影响络合物的稳定性。因此，适宜的平衡温度对萃取效果、效率影响较大。在保证萃取完全的条件下，选择较短的平衡时间可以直接提高分析效率。为此，考察平衡温度与时间对体系吸光度的影响（图3、图4），由图3可知，平衡温度为70～80 ℃，萃取效率最高，由图4可知平衡15 min萃取效果最好。

2.2.3 TritonX-100用量对萃取效果的影响 非离子表面活性剂TritonX-100的用量不仅决定了铜富胶束相体积的大小，同时还会影响萃取分相过程。试验考察了TritonX-100用量对萃取效果的影响（图5），发现加入量小于2.0 mL时萃取不完全从而降低萃取效果，加入量大于2.0 mL时，萃取效果没有十分明显的变化。

2.2.4 络合剂用量对萃取效果的影响 二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC）对铜离子具有较高的生产常数，且生成物二乙基二硫代氨基甲酸铜具有疏水好的特点，是一种理想的络合剂，它除了能与试样中的铜离子生成络合物到胶束相中之外，还起到显色的作用。用量过少导致络合不完全从而使吸光度偏低，用量过多则会造成浪费，导致成本过高。本试验考察DDTC用量在0.5～2.5 mL时对萃取效率的影响（图6）。由图6可知，用量为1.5 mL时萃取效率最好。

2.3 正交试验

由表2、表3的分析结果可知，溶液的pH值、萃取平衡温度、 平衡时间、非离子表面活性剂TritonX-100用量、二乙基二硫代氨基甲酸钠用量等5个影响因素中，各因素影响程度顺序是溶液的pH值>平衡温度>二乙基二硫代氨基甲酸钠用量>非离子表面活性剂TritonX-100用量>平衡时间。方差分析表明，溶液的pH值与平衡温度对测定结果有显著影响。优化工艺条件为：溶液的pH值为8.0，萃取温度为 70 ℃，萃取时间为20 min，TritonX-100（体积分数为10%）的用量为 2.0 mL，二乙基氨基二硫代甲酸钠（0.4%）为 1.5 mL。

2.4 分析特性

在最优试验条件下以不同浓度（0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL）铜标准溶液按照试验方法进行测定，结果显示，在0～0.5 μg/mL范围内，吸光度与铜浓度之间存在良好的线性关系，线性回归方程为D=0.130 6C+0.000 43，相关系数r=0.999 1，检出限为0.48 μg/mL（n=11）。

2.5 样品分析

在最佳试验条件下分别测定荞面菌、奶浆菌、红蜡蘑、铜绿菌中的铜，并进行加标回收试验（表4），由表4可知，样品加标回收率在99.26%～101.15%，相对标准偏差均小于 3.40%。对照国标法与本试验方法测定的结果（表5），可知本试验所用测定方法可靠。

3 结论

建立二乙基氨基二硫代甲酸钠为络合剂、非离子表面活性剂TritonX-100为萃取剂测定4种食用野生菌中銅含量的浊点萃取-光度法联用的新方法。得出最佳试验条件为pH值8.0，萃取温度70 ℃，萃取时间20 min，TritonX-100（体积分数为10%）的用量2.0 mL，二乙基氨基二硫代甲酸钠（0.4%）1.5 mL，在最优条件下，铜的线性范围0～0.5 μg/mL，线性回归方程为D=0.130 6C+0.000 43（r=0.999 1），检出限为0.48 μg/mL（n=11），相对标准差RSD<3.4%（n=5），样品加标回收率在99.26%～101.15%。研究结果表明，该方法与现行国标法相比更环保，操作简单、分析速度快、结果准确。将该方法用于4种野生菌中铜含量测定，结果令人满意。本研究的测定结果可以为4种野生菌进一步开发和应用奠定化学基础。

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