利用地塞米松构建建鲤肝切片脂变模型

王涛+曹丽萍+杜金梁

摘要：用地塞米松构建建鲤肝切片脂变模型，并探索最佳建模浓度，初步探究地塞米松致建鲤肝脏脂变的作用机理。建鲤活体取肝，用振荡切片机制备厚度为300 μm的建鲤肝切片，27 ℃培养箱中预培养2 h。将试验分为试验组和空白对照组，试验组用含浓度为0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L地塞米松的L-15培养基于 27 ℃ 培养箱中培养12 h，空白对照组用L-15培养基培养相同时间，培养结束后，收集试验组和空白对照组中上清液和肝切片。参照试剂盒说明检测上清液中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性，肝切片匀浆中三磷酸腺（ATP）、总蛋白（TP）含量，甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、游离脂肪酸（FFA）含量以及脂肪酸合成酶（FAS）活性。结果显示，建鲤肝切片经地塞米松诱导后，ATP含量变化不大；当地塞米松浓度为3.93 mg/L时，试验组的其他指标与空白对照组差异极显著（P<0.01）。由此说明，用浓度为3.93 mg/L地塞米松诱导建鲤肝切片12 h可以成功构建建鲤肝切片脂变模型。

关键词：建鲤；肝切片；地塞米松；脂变；脂肪肝；糖皮质激素

中图分类号： S941.8 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0146-04

肝脏作为生物体内的重要器官，在能量代谢和物质循环中具有重要作用，同时也是蛋白质、脂肪合成的重要场所[1]。近年来，随着水产养殖的迅速发展，鱼类脂肪肝和肝肿大普遍存在，但目前还没有较好的治疗方法，患病鱼类品质下降，抗病能力降低，严重影响水产养殖健康持续发展。鱼类脂肪肝的成因复杂，普遍认为，养殖条件下投喂营养不均衡的配合饲料（如高糖、高脂）以及养殖期间投喂过量，造成肝脏脂类物质代谢发生障碍，脂肪沉积于肝脏的速度远远超过脂肪转移的速度，导致甘油三酯在肝细胞内异常沉积[2]。然而，有关高等哺乳动物的研究表明，脂肪肝的形成与糖皮质激素慢性升高有密切联系[3]。许多研究证实，糖皮质激素影响肝脏脂肪代谢，诱导脂肪肝和肝肿大[4-6]；过多的脂肪沉积是糖皮质激素造成脂肪肝和肝肿大的主要原因[7]。

集约化养殖条件下，鱼类受多种应激因子刺激。当应激原存在时，下丘脑-脑垂体-肾间组织轴受到刺激，使促肾上腺皮质激素（adreno cortico tropic hormone，简称ACTH）分泌增加，ACTH作用于肾间组织，从而引起糖皮质激素（皮质醇）分泌增加，导致血液中糖皮质激素含量升高[8]。急性应激常常导致皮质醇含量数倍甚至数十倍地增加，而慢性应激（如高密度养殖时的拥挤胁迫等）则使血液中皮质醇含量在数周后仍然保持较高水平，但也有皮质醇在1周后恢复到正常水平[9]。

本试验用不同浓度的地塞米松模拟鱼体内不同含量的糖皮质激素，恒温培养的建鲤肝切片模拟鱼体内肝脏，构建由地塞米松引起的建鲤肝脏脂变模型。目前，用地塞米松构建肝脏脂变模型并不陌生，国内外学者单独或与高脂饮食并用构建小鼠急性脂肪肝模型，但主要集中在陆生动物上，对水生动物研究较少。殷国俊等将孵化出96 h的斑马鱼暴露在添加50 mg/L地塞米松的水中，经过24 h后，斑马鱼的肝脏显著增大了40%，此阶段的斑马鱼是卵黄囊为内源性营养，表明地塞米松在没有外源性营养的情况下，可以诱导斑马鱼的肝肿大（注：相关试验尚未公开发表）。刘英娟等单独使用四氯化碳成功构建鲤鱼肝细胞脂变模型，用该模型成功筛选出护肝中药枸杞多糖[10]；卢荣华等用脂肪乳剂成功构建草鱼肝细胞脂变模型[11]；国外学者在青鳉鱼上成功构建肝脏脂變模型，并用该模型成功筛选出护肝药物[12]。该试验通过地塞米松诱导建鲤肝切片12 h后，成功构建建鲤肝脏脂变模型，为筛选相关治疗药物提供理论模型。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

试验用建鲤取自中国水产科学院淡水渔业研究中心渔场，体质健康无病。将建鲤放入循环水系统暂养1周，养水温度为25 ℃，每天定时定量投喂商品饲料。

1.2 主要试剂和仪器

地塞米松（dexamethasone）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，简称DMSO），购于美国Sigma公司；谷丙转氨酶（glutamate pyruvic transaminase，简称GPT）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，简称GOT）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，简称ATP）、总蛋白（total protein，简称TP）、甘油三脂（triglyceride，简称TG）、总胆固醇（total cholesterol，简称TC）、游离脂肪酸（free fatty acids，简称FFA）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，简称FAS）等试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；振荡切片机、723分光光度计，购自上海欣茂仪器有限公司；酶标仪MK3，购自美国Thermo公司。

1.3 建鲤肝切片的制备与培养

无菌条件下，建鲤消毒麻醉后，超净台内取出肝脏并置于PBS缓冲液中，持续通入含95% O2、5% CO2的混合气体。用PBS缓冲液清洗肝组织3次后，用解剖刀处理成体积为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肝组织块，2%的低熔点胶包埋，30 min后固定肝组织，振荡切片机制备厚度为300 μm的肝切片。将上述肝组织切片置于含1 mL L-15培养基的24孔板中。

1.4 试验设计

本试验设试验组和空白对照组，每组4个重复；试验前，各组用L-15培养基27 ℃恒温箱中预培养2 h后，吸弃上清。空白对照组换用新鲜L-15培养基继续培养12 h，试验组用含浓度为0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L 地塞米松的L-15培养基培养相同时间，试验结束后收集上清液和肝切片。

1.5 建鲤精密肝切片活力检测

建鲤肝切片经地塞米松诱导12 h后收集并称其质量，加入9倍体积的沸双蒸水，制成10%的组织匀浆，沸水中煮 10 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按ATP测试盒说明书测定三磷酸腺苷含量。

1.6 生化指标测定

地塞米松诱导建鲤肝切片12 h后，收集上清液和肝切片。按试剂盒说明书分别测定TP、FFA、TG、TC的含量，GPT、GOT、FAS活性。

1.7 数据分析

试验数据用SPSS 22.0进行整理分析。采用One-Way ANOVA检验法进行显著性分析，结果以“平均值±标准差”表示。其中，在0.01水平上差异显著用“**”表示，在0.05水平上差异显著用“*”表示。

2 结果与分析

2.1 地塞米松对建鲤肝切片活性的影响

由图1可知，建鲤肝切片经地塞米松诱导12 h后，试验组与空白对照组相比，ATP含量虽然有所降低但差异不显著（P>0.05）。由此推断，在该浓度剂量范围内，地塞米松对建鲤肝切片活性的影响较小。

2.2 地塞米松对建鲤肝切片抗氧化能力的影响

由图2可知，随着地塞米松浓度的增加，超氧化物歧化酶的活性先降低，然后保持相对稳定。当地塞米松浓度超过0.393 0 mg/L时，试验组与空白对照组差异显著（P<0.01）；当浓度超过3.93 mg/L后超氧化物歧化酶活性保持相对稳定。

2.3 地塞米松對建鲤肝切片中总蛋白含量的影响

由图3可知，随着地塞米松浓度的增加，总蛋白含量先逐渐降低后保持相对稳定，当浓度达到3.930 0 mg/L时，总蛋白含量达到最低点；超过该浓度，总蛋白含量保持相对稳定。

2.4 地塞米松对建鲤肝切片中GPT、GOT活性影响

如图4可知，GPT、GOT的活性随着地塞米松浓度的升高，先增加后保持相对稳定，在浓度为0.393 0 mg/L时，试验组与空白对照组差异显著（P<0.05）；地塞米松浓度达到并超过3.930 0 mg/L时，GPT、GOT的活性保持相对稳定。

2.5 地塞米松对建鲤肝切片中游离脂肪酸（FFA）含量、脂肪酸合成酶（FAS）活性的影响

如图5可知，试验组与空白对照组相比，当地塞米松浓度为0.393 0 mg/L时，建鲤肝切片匀浆中FFA含量和FAS的活性均出现差异显著性（P<0.05）；当地塞米松浓度为3.930 0 mg/L 时差异显著（P<0.01），超过该浓度时FFA含量和FAS活性均保持相对稳定。

2.6 地塞米松对建鲤肝切片匀浆中TC、TG含量的影响

由图6可知，建鲤肝切片中TC、TG的含量随着地塞米松浓度的增加先增加后保持稳定，当地塞米松浓度达到0.393 0 mg/L 时，试验组与空白对照组TC、TG含量差异显著（P<0.05）；浓度达到并超过3.930 0 mg/L后，TC、TG含量达到最大值且保持相对稳定。

3 讨论

生物体内三磷酸腺苷（ATP）作为能量转换载体，ATP含量变化直接影响器官的能量代谢[13]。因此，试验中将ATP含量作为评价器官活性的重要指标。从图1可以看出，试验组较空白对照组相比ATP含量有所降低，但差异并不显著（P>0.05）。由此可以推断，建鲤肝切片经地塞米松诱导后活性依然良好。试验组ATP降低可能是因为地塞米松上调磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，简称PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，简称G-6-pase）的表达，促进糖异生，并降低组织细胞对葡萄糖利用效率，抑制线粒体合成ATP[14]。但从本试验的结果可以推测这种抑制作用是有限的，试验中的建鲤肝切片活性良好。

SOD作为机体内重要的抗氧化酶[15]，能有效清除机体内超氧化物自由基，有效防止自由基对机体的损害。图2显示，随着地塞米松浓度的增加，试验组中SOD的活性先逐渐降低，然后保持相对稳定，在浓度为0.393 0 mg/L时，试验组与空白对照组差异显著（P<0.05），当浓度达到并超过3.930 0 mg/L 时，SOD活性保持相对稳定。

GPT和GOT是内源性转氨酶，因此常常通过检测细胞培养上清液中GPT和GOT活性来判断细胞受损程度[16]。本试验中GPT和GOT的活性先是随着地塞米松浓度的增加而增加，当浓度达到3.930 0 mg/L时活性达到最大且保持相对稳定。说明地塞米松对建鲤肝切片造成了一定的损伤，这种损伤可能与地塞米松促进磷脂氧化，增强脂质过氧化连锁反应，增加质膜的流动性，改变细胞膜的通透性有关。

肝脏在蛋白质的合成与分解过程中具有重要的调节作用，动物血浆中的蛋白质几乎全部在肝脏中合成。当肝脏受到外界刺激发生损伤后，功能发生紊乱，蛋白质的合成受阻[17-18]。本试验中建鲤肝切片经地塞米松诱导12 h后，试验组与空白组相比，蛋白质含量变化明显。导致该试验结果的主要原因可能是地塞米松影响单个核糖体组装成多聚核糖体的效率，降低翻译能力，进而减弱蛋白质合成相关基因的表达而降低蛋白质的合成[19]。不仅如此，地塞米松通过激活肝细胞内溶酶体和泛素蛋白酶体蛋白水解途径促进蛋白质降解[20]。由图3可以看出，当地塞米松浓度达到3.930 0 mg/L时，蛋白质含量达到最小值，超过该浓度，蛋白质含量保持相对稳定。说明该浓度的地塞米松能有效抑制肝脏对蛋白质的合成，促进蛋白质的分解。

肝脏不仅在蛋白质代谢过程中起重要作用，而且与脂肪代谢密切相关。已有研究证实，地塞米松可以提高肝X受体（1iver X receptors，简称LXRs）mRNA基因的表达，肝X受体合成分泌增加[21]。肝X受体上调固醇调节元件结合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，简称SREBPs）基因的表达，从而间接促进脂肪酸合成相关基因FAS、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，简称ACC）基因的表达[22]。也有研究人员发现，地塞米松能增加体外培养细胞中FAS的活性，直接促进脂肪酸合成的作用[23]，在本试验中由图5-b可知，建鲤肝切片经地塞米松诱导后，FAS活性明显上升，并随着地塞米松浓度的增加而逐渐增强，在浓度为 3.930 0 mg/L 时达到最大值，之后保持相对稳定。

正常情况下，肝脏中的FFA脂化为TG，蛋白质与TG结合成脂蛋白，然后转运出肝脏参与血液循环[24]；TC则一部分氧化生成胆汁进入胆囊，另一部分与蛋白质结合后以低密度蛋白和高密度蛋白的形式转运出肝脏参与血液循环[25]。本试验中，由于地塞米松对建鲤肝切片的诱导作用，FAS合成分泌增加，导致肝脏中FFA含量升高，过多的FFA对肝脏具有毒害作用，而造成“初次打击”[26]；此外，FFA通过线粒体β氧化产生过氧化物ROS，再次对肝脏产生毒害作用而产生“二次打击”[27]。在地塞米松浓度达到3.930 0 mg/L后，建鲤肝切片因遭2次“打击”受损程度最为明显，试验组与空白对照组差异显著（P<0.01）。此外，肝脏中的TG含量随FFA含量增加而增加，TC含量也随肝脏中蛋白质的减少而增加。肝脏中FFA、TG、TC含量异常变化最终导致肝脏脂肪代谢异常而脂变，甚至演变成脂肪肝。

4 结论

通过本试验得出如下结论：地塞米松对蛋白质、脂肪代谢具有重要调节作用。用浓度为3.930 0 mg/L地塞米松诱导建鲤肝肝切片12 h能成功构建建鲤肝切片脂变模型。

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