斑点叉尾MSTN基因4个SNP位点及其与生长性状的相关性

张世勇+王明华+钟立强

摘要：采用DNA混池测序法筛选斑点叉尾肌肉生长抑制素（MSTN）基因SNP位点，同时使用SNaPshot法将筛选到的SNP多态性位点进行分型，最后与生长性状进行关联分析。共筛选到4个SNP位点，即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C。其中，g.3501 T>G位于第一内含子；g.3844 T>A位于第二外显子，并造成密码子GUA变为GAA，氨基酸由缬氨酸（Val）变为谷氨酸（Glu）；g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二内含子。关联分析结果表明，SNP位点g.4355 G>C与斑点叉尾的体质量和体长呈显著性负相关，具有GG基因型个体的体质量和体长显著性低于CC型和CG型（P<0.05），该位点可作为斑点叉尾分子育种的候选分子标记。

关键词：斑点叉尾；MSTN；SNP；SNaPshot；生长性状；关联分析

中图分类号： Q953；S917 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0030-03

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）是骨形成蛋白家族（bone morphogenetic protein family）和TGF-β超家族成员之一，又被称为生长分化因子8（growth and differentiation factor 8，GDF-8）。MSTN基因是肌肉生长发育的关键基因，它编码的蛋白是骨骼肌生长的负性调控因子。McPherron等敲除小鼠的MSTN基因，发现小鼠骨骼肌生长加快[1]；在斑马鱼中进行的MSTN基因敲除试验具有类似的试验结果[2]。脊椎动物中MSTN基因的结构和功能具有较高的保守性[3]，因此可将MSTN基因作为哺乳动物及鱼类等物种的候选生长相关基因。

斑点叉尾（Ictalures punctatus）别称美洲鲇、沟鲇，属于鲇形目（Siluriformes）科（Ictaluridae），原产于美国，是一种重要的水产经济类物种，具有肉质细腻、适温范围广、生长速度快、抗病能力强等特点，2013年全世界养殖产量为 419 215 t[4]。斑点叉尾自1984年引入国内后，养殖规模和产量逐年增加，2013年我国养殖产量占全世界的一半以上，产量达224 132 t[5]。随着我国斑点叉尾养殖产业的快速发展，已经出现明显的生长减慢、体色分化、规格不齐等种质衰退现象[6]；因此，培育生长快、抗逆性强的斑点叉尾新品种（系）已成为当前斑点叉尾产业可持续发展亟待解决的重要问题。本研究将MSTN基因作为斑点叉尾生长发育性状的候选基因进行了SNP多态性检测，并将筛选到的SNP位点与生长性状进行关联分析，旨在为斑点叉尾分子标记辅助育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

供试斑点叉尾样本均来自江苏省淡水水产研究所禄口试验基地。于2013年6月进行家系培育，为减小环境对斑点叉尾生长的影响，苗种培育按照同一标准进行，即均一的换水速率、投喂量、养殖密度、充氧量、水温。待稚鱼日龄为30 d时，每个家系随机选取300尾于室外水泥池进行培育。家系日龄达到120 d时，每个家系随机选取50尾鱼注射RFID电子标记，并记录每尾鱼的电子编号、家系编号、体质量、体长等信息。标记后将鱼移至土池培育，家系平均日龄为520 d时，扫描并记录存活个体编号，测量个体的体质量、体长等信息。同时采集每尾鱼的尾鳍组织，放入95%乙醇中，于 -20 ℃ 下保存。

1.2 基因组DNA提取

斑点叉尾尾鳍DNA的提取使用UNIQ-10型柱式动物基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司），按照试剂盒说明书进行操作。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，采用紫外分光光度计测定DNA样品浓度。

1.3 引物设计

根据NCBI GenBank数据库公布的斑点叉尾MSTN基因序列（AF396747.1），采用Primer Premier 5软件设计2对引物（表1）。第1对引物（P1）主要用于扩增第一外显子及5′非编码区、第一内含子部分序列，第2对引物（P2）主要用于扩增第二外显子、第二内含子、第三外显子及第一内含子、3′非编码区部分序列。

1.4 PCR扩增及测序

随机抽取40尾斑点叉尾的DNA样品，将每个样品的质量浓度调整至100 ng/μL ，各取1 μL 混合构建DNA池。以DNA池和20尾个体基因组DNA为模板，利用所设计的2对引物进行PCR扩增。采用即用型UtraTaq酶PCR试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）进行PCR扩增。40 μL PCR反应体系为：2×UltraTaq Master Mix试剂20 μL、基因組DNA 2 μL、上游及下游引物（质量浓度为10 pmol/μL）各2 μL、ddH2O 14 μL 。采用BIOMETRA T1型PCR扩增仪进行扩增，PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用凝胶成像仪观察电泳结果。PCR产物纯化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司，直接采用ABI 3730XL型测序仪测序。所得结果使用Chromas软件观察测序峰图，并结合使用ClustalX软件进行DNA序列比对，判断SNP位点的碱基类型。

1.5 SNaPshot法SNP分型

采用SNaPshot法对4个家系共176尾鱼进行SNP位点分型。根据SNP位点侧翼序列设计扩增引物，使扩增片段长度为200～500 bp。延伸引物3′端第1个碱基紧邻待测SNP位点，Tm值为50 ℃以上，并且在引物的5′末端加上不同长度的Poly C或Poly T。

采用Touchdown PCR程序进行多重PCR扩增，20 μL 反应体系为：0.8 μL MgCl2（50 mmol/L）、2 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free）、0.5 μL dNTP（10 mmol/L）、0.5 μL混合引物、1 μL 模板DNA、0.5 μL Platinum Taq（5 U），其余用ddH2O补足。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，60 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；共11个循环，每个循环退火温度降低0.5 ℃；94 ℃变性15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共24个循环；72 ℃延伸5 min。反应完成后进行PCR产物纯化，10 μL 反应体系为：FastAP（Thermosensitive Alkaline Phosphatase，Fermentas）0.8 μL、ExoⅠ 0.2 μL、ExoⅠ buffer 0.7 μL、PCR产物3 μL、H2O 5.3 μL 。反应条件为37 ℃ 15 min，80 ℃ 15 min，纯化后进行延伸反应，并预先混匀延伸引物。

SNP分型采用ABI SNaPshot Multiplex PCR试剂盒（美国应用生物系统公司），6 μL 反应体系为：Snapshot Mix 1 μL、延伸引物0.1 μL、多重PCR产物2 μL、ddH2O 2.9 μL 。反应条件为：96 ℃预变性1 min；96 ℃变性10 s，52 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，共30个循环。反应结束后加入1 U FastAP，并以37 ℃ 60 min、85 ℃ 15 min条件进行纯化。以GeneScan-120Liz Size Standard（ABI）为内标，取1 μL 产物与9 μL 含有Liz的Hi-Di（GS-120Liz ∶Hi-Di=1 ∶200）混合，95 ℃变性3 min，立即冰浴3 min后上测序仪。采用ABI PRISM 3730 XI型自动遗传分析系统进行检测及分析，并利用Genemapper v4.1软件进行分型。

1.6 数据统计

利用R（3.0.1）软件对试验斑点叉尾SNP位点的各基因型体质量、体长进行方差齐性分析（homogeneity of variance test）和单因素ANOVA（one-way ANOVA）分析。采用均值多重比较（multiple comparisons of means）方法分析SNP位点各基因型与生长性状的关联程度。统计分析模型为：

Yij=μ+Gi+eij。

式中：Yij为某个性状第i个标记第j个个体观测值，μ为试验观测所有个体的平均值（即总体平均值），Gi为第i个标记的效应值，eij为对应于观察值的随机残差效应。

2 结果与分析

2.1 MSTN基因SNP位点筛选

利用所设计的2对引物对40尾斑点叉尾构建的DNA池及20尾个体进行PCR扩增和测序分析。共筛选出4个SNP位点，即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C，且所有位点均由第2对引物扩增得到。其中，g.3501 T>G位于第一内含子；g.3844 T>A位于第二外显子，密码子GUA变为GAA，氨基酸由缬氨酸（Val）变为谷氨酸（Glu）；g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二内含子（图1）。

2.2 SNP位点的关联分析

对斑点叉尾4个家系176尾鱼的体质量和体长进行统计分析，数据以“平均值±标准误”表示。体质量、体长分别为（280.63±13.21） g、（31.26±0.56） cm。采用R软件将筛选得到的4个SNP位点与测量的斑点叉尾体质量、体长进行单因素ANOVA分析，并结合均值多重比较分析得出，4个SNPs中的1个（g.4355 G>C）与斑点叉尾体质量、体长呈显著性负相关（表2）。在SNP位点g.4355 G>C，具有GG基因型個体的体质量、体长显著性低于CC型和CG型（P<005）。

3 结论与讨论

MSTN基因具有多种重要功能，它在哺乳动物中的主要功能为调节胚胎发育过程中肌纤维的数量，以及抑制肌纤维的生长[1]。MSTN基因多态性及其与生长性状的关联分析研究最早于哺乳动物中进行，绵羊、猪、中国肉牛等[7-11]均已发现突变位点与生长性状之间存在相关性。近年来，在鲤鱼、罗非鱼、黄颡鱼、圆斑星鲽、鲈鱼、鳙鱼等[3，12-18]重要的水产动物中也开展了相关研究。唐永凯等在吉富罗非鱼中筛选到1个与增质量显著相关的SNP位点[13]。朱媛媛等、陈校辉等先后对黄颡鱼MSTN基因进行研究，均发现了造成不同个体间生长性状显著性差异的SNP位点[14-15]。

本研究在斑点叉尾MSTN基因中共筛选到4个SNP位点，其中1个SNP位点位于第二外显子，其余3个均位于内含子区域。将筛选到的SNP位点与生长性状进行关联分析，结果表明SNP g.4355 C>G与生长性状显著相关。具有GG型个体的体质量、体长显著低于CC型和CG型， GG型个体的平均体质量、平均体长分别比4个家系所有个体体质量、体长的平均值小30%、10%。4个家系中的个体以CC型和CG型为主，具有GG型的个体较少。综合推测该位点GG型属于隐性突变，由于该位点碱基突变造成MSTN基因的表达量升高，进而抑制了斑点叉尾的生长。这种现象也存在于猪[9]、牛[11]、红鳍东方鲀[3]的研究中。

本研究获得的与生长性状显著关联的SNP位点位于内含子区域。尽管内含子不具有编码蛋白质的能力，但其发生单核苷酸突变能够显著影响基因的表达效率。已有研究表明，内含子的功能主要为转录调控，即在转录阶段对相应的基因进行调控进而影响生长性状[19]。越来越多的试验结果证明，内含子在调控mRNA剪切、转录、基因表达方面起着重要作用[20-21]，例如内含子长链非编码RNA（intronic lncRNA）发生单核苷酸突变将使其调控的转录本表达水平发生改变。然而，本研究中该SNP位点参与调控MSTN基因功能的具体机制有待进一步研究。