LY294002对高糖培养原代足细胞snail表达的影响

贾苗　谢玉贤　邱宏　李冰燕

【摘要】 目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002对高糖培养的大鼠肾小球足细胞snail表达的影响，为进一步研究糖尿病肾病足细胞损伤的机制提供依据。方法：体外培养大鼠原代肾小球足细胞，经细胞免疫荧光法鉴定。足细胞分化完全后同步化，分为正常糖组、甘露醇对照组、高糖组、高糖+LY294002（2 mg/L）组，培养上述细胞48 h后观察细胞形态，Western blot法半定量检测snail的表达。结果：高糖可导致足细胞足突消失，细胞体积变大，snail表达增强（P<0.05）。与高糖组相比，高糖+LY294002（2 mg/L）组可部分抑制高糖导致的snail表达增强（P<0.05）。结论：PI3K抑制剂可部分阻断高糖导致的足细胞snail表达。

【关键词】 高糖； 足細胞； PI3K抑制剂； snail

Effect of LY294002 on Snail of Glomerular Podocytes under High Glucose Condition in Rats/JIA Miao，XIE Yu-xian，QIU Hong，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：027-030

【Abstract】 Objective：To evaluate the effect of the blocker of PI3K LY294002 on the expression of snail in high glucose-induced podocyte cell.Method：The glomeruli were isolated and gathered for primary culture.The cells were randomized into normal glucose（NG） group，high glucose（HG） group，mannitol control（MG） group，HG+LY294002（2 mg/L）group. The culture was continued for 48 h.The expression of snail was observed with Western blot methods.Result：Compared with NG group，the podocytic-process retraction and partial effacement and intercellular junction losing appeared in HG group，the expression of snail was increased（P<0.05）.Compared with HG group，there was a down-regulation of the expression of snail（P<0.05）.Conclusion：PI3K inhibitor protects podocytes by partly inhibiting the expression of snail.

【Key words】 Glucose； Podocytes； LY294002； Snail

First-authors address：The Peoples Hospital of Suzhou National New & Hi-tech Industrial Development Zone，Suzhou 215129，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.007

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） 是生物体内重要的细胞内激酶。其主要的下游是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt。PI3K/Akt信号通路在细胞代谢、凋亡、增殖与分化等方面发挥着重要作用[1-2]。snail作为一种锌指转录因子，其可以与E-cadherin启动子上的E-box结合，从而使上皮细胞粘附分子E-cadherin的表达下调，使上皮细胞间的粘附性降低，参与上皮细胞的转分化[3]。目前关于snail在肾病方面的研究多集中在肾小管上，对足细胞的研究较少。本研究通过观察LY294002对高糖培养的大鼠原代足细胞snail表达的影响，旨在为糖尿病肾病的诊疗提供新的理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 雄性SD大鼠200～220 g购自上海斯莱克实验动物中心，质量合格证号2007000580977，实验动物使用许可证号码SCXK（沪）2012-0002。兔抗snail、synaptopodin购自美国Abcam，LY294002购自Sigma-Aldrich Corporation，DMEM-F12培养基、RPMI无糖培养基、培养基添加物ITS、胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠肾小球足细胞原代培养与鉴定 采用差异过筛法分离大鼠肾小球，方法参见文献[4-5]。无菌取肾后分离肾皮质后轻柔研磨并逐层分别通过80、150、200目筛网，收集200目筛网上的肾小球，并将其接种于细胞瓶中，采用翻转法培养，放置于37 ℃ 5%CO2恒温恒湿培养箱内，孵育4.5 h后将培养瓶翻转过来使其正常放置。第7～8天后，首次传代后的细胞培养7 d，待细胞长满瓶底后行倒置相差显微镜观察足细胞形态，并采用synaptopodin鉴定足细胞。

1.2.2 实验分组 使用正常糖培养基培养7 d至足细胞分化完全，相互间形成广泛连接，用无血清培养基继续培养24 h使各组细胞同步化。按下述分组分别更换不同培养基继续生长48 h。（1）正常浓度葡萄糖组（NG，GS 5 mmol/L）；（2）甘露醇对照组（MG，甘露醇30 mmol/L）；（3）高糖组（HG，GS 30 mmol/L）；（4）HG+LY294002（GS 30 mmol/L+ LY294002 2 mg/L）

1.2.3 Western-blot法检测各组细胞蛋白表达 培养48 h后收集细胞，加入蛋白裂解液提取各组蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后分别放于-70 ℃保存。每组样本取50 μg总蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳后在冰盒中电转至PVDF膜；5%脱脂奶粉37 ℃恒温箱中封闭2 h，再分别加入兔抗snail（1∶200稀释）、GAPDH多克隆抗体，4 ℃冰箱摇床上孵育过夜。洗膜后用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000）室温孵育1 h，ECL化学发光法显色。WB条带信号强度采用Lab Work45图像分析软件系统进行半定量分析，测定各个条带的积分光密度值（IOD），以snail与内参GAPDH条带的IOD比值代表其蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0軟件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间两两比较采用LSD方法分析，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 足细胞原代培养结果及鉴定 消化传代后的足细胞呈星形，细胞质和细胞核较增殖状态明显增大，最大直径可达500 μm，自细胞体伸出树枝样突起，常见双核，相邻细胞间形成连接，7 d后呈完全分化状态，见图1～3。免疫荧光鉴定显示表达synaptopodin，见图4。

2.2 实验组观察结果 各组细胞形态学比较：HG组培养12、24、48h均出现足突回缩，直至足突消失及失去细胞间连接，随培养时间延长而加重，尤以48h最明显。

2.3 LY294002对snail蛋白表达的影响 与正常糖组比较，高糖组snail表达增强（P<0.05）。与高糖组相比，高糖+LY294002（2 mg/L）组可部分抑制高糖导致的snail表达增强（P<0.05），见图5和6。

3 讨论

随着糖尿病发病率的逐年提高，其主要的微血管并发症糖尿病肾病（DKD）也已成为发达国家及我国发达城市终末期肾病的最主要原因，严重危害人类健康，并占国家财政支出的重要一部分。2型糖尿病肾病患者肾脏病理变化包括系膜增生、细胞外基质积聚、基底膜增厚，最终发展成肾小球硬化和广泛间质纤维化[5]。近年的研究发现，DKD的主要发病机制为足细胞病，足细胞损伤和脱失在糖尿病肾病发生中的作用举足轻重[6]。大量研究表明，在足细胞脱失前存在足细胞损伤[7]。足细胞和肾小管上皮细胞均起源于胚胎中胚层的间叶细胞，故尽管足细胞是终末分化细胞，但仍然具备在病理条件下转分化成间叶细胞的可能，其转分化后可获得分泌功能，从而使细胞外基质（ECM）分泌过多，导致肾小球硬化并最终发展至纤维化[8]。上皮细胞改变其形态转变为（肌）成纤维细胞的转分化过程称为上皮-间质细胞转换（EMT）[9-10]。典型的上皮通常只有一层细胞，上皮细胞具有极性而且细胞与细胞之间通过紧密连接、间隙连接、黏合连接等规则排列，从而阻止细胞从上皮分离、转移。然而，由于间质细胞间缺少稳定的细胞连接，从而形态不规则，具有移动能力。EMT过程中，上皮细胞失去细胞间以及与细胞外基质的连接，导致细胞与周围细胞和基膜的分离并且获得间质样细胞的生物特征，最终能够从原发组织中转移。上皮细胞转变为间质细胞时，细胞的形态、结构、粘连性以及转移能力都将发生显著变化[11-12]。EMT导致肾脏纤维化是肾脏长期损伤或正常伤口愈合过程中功能失调，导致过量的ECM沉积。snail家族属于锌指转录因子，于1984年首次在黑腹果蝇胚胎中发现。snail基因在肿瘤侵润、转移及胚胎发育中起着关键作用。文献[13]通过在鸡胚胎上施行Slug功能缺失实验，首次证明snail基因家族具有触发上皮-间质细胞转换的作用。

snail可通过其锌指区域与E-cadherin启动子区E盒主链上的CAGGTG序列结合而发挥其下调E-cadherin的作用，从而启动EMT的关键步骤[3]。另外，snail能通过P13K信号通路及促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活促进金属基质蛋白酶9（MMP 9）转录，从而使表达snail的细胞获得侵袭特性。

目前snail与肾脏纤维化的研究主要集中在肾小管上皮细胞中，其在多种肾病模型的肾小管上皮细胞的表达上调，可以诱导肾小管上皮细胞发生EMT，促进肾脏纤维化[14-15]。对于DKD足细胞snail表达情况鲜有研究，本实验观察到高糖环境下足细胞大量表达snail，与已有的研究结果一致[16-20]。逆转足细胞功能损伤可能延缓或减轻DN的进展，因此探讨足细胞转分化的机制，并进一步干预并阻断该过程至关重要。PI3K/Akt信号通路参与多种细胞的生长与增殖，该过程主要与细胞有丝分裂有关，其促进有丝分裂的靶点主要是Akt活化后产生的下游分子，包括mTOR、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）、真核启动因子4E结合蛋白（4EBPS）等，同时通过磷酸化CDK1（p21Cip1与p27Kip1），正调控cyclin/CDK，因此阻断该信号通路的活化将抑制细胞的增殖。PI3K催化亚基p110的靶向抑制LY294002可以阻断3-磷酸肌醇的产生，进而阻断此通路的活化，从而抑制肿瘤细胞的生长[1]。

本研究通过LY294002阻断PI3K的通路，可降低高糖环境下足细胞snail的表达，说明PI3K信号通路可能参与调控高糖诱导的足细胞EMT。本研究初步探讨了PI3K信号通路与snail在高糖环境下足细胞中表达的关系，为今后临床DKD的防治提供了新的干预思路。

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（收稿日期：2016-11-18） （本文編辑：程旭然）