萍乡地区RhD阴性人群基因多态性分析

巫文勋+王长奇+阳福桂

Rh血型系统是红细胞血型系统中最为复杂的血型系统之一，具有复杂的遗传多态性，其临床意义仅此于ABO血型系统。Rh血型系统目前已发现49种抗原，以C、e、D、E、e这5种抗原在临床上最为重要，尤其是D抗原，它是除ABO血型系统外最强的红细胞抗原，具有极强的免疫原性，是造成迟发性溶血性输血反应最常见的原因[1]。因此，鉴定RhD抗原表型被列为临床输血检测常规项目[1]。编码Rh血型抗原为2个高度同源性的基因：RhD基因和RhCE基因。RhD编码D抗原，RhCE编码CcEe抗原。近年来，有些研究发现一些血清学初筛阴性的个体经进一步检测，发现一部分人有D抗原的存在。因此，为了解萍乡地区Rh阴性人群基因多态性状态，经序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）方法进行基因学检测，比较血清学结果与基因学结果的异同。

1资料与方法

1.1一般资料 收集我院2011年5月～2015年1月住院及门诊患者2035例标本进行了RhD抗原检测，RhD阴抗原性率为0.88%[2]，对130例RhD阴性标本进行了检测，其中男性60例，女70例，年龄20～75岁。标本为采用EDTA抗凝的全血3 ml。

1.2仪器与试剂 美国ABI 9700 PCR扩增仪，Thermo离心机。Alphalmager凝胶成像系统，Tanon EPS 300电泳仪，紫外分光光度计，日本富士DNA提取试剂盒，天津秀鹏生物技术有限公司的RhD基因检测试剂盒，江阴力博医药生物技术有限公司的RhD血型定型试剂。

1.3方法

1.3.1 RhD血型血清学鉴定 将血样混匀洗涤3次，配成5%红细胞悬液，取1滴加入试管中，再向试管中加入2滴IgG的抗D试剂，37℃孵育30 min。然后用生理盐水反复洗涤3次，弃上清液，再加入广谱抗人球蛋白试剂，1000 r/min离心1min，观察结果。有凝集者为RhD阳性，无凝集者为RhD阴性。

1.3.2 RhD血型基因学检测

1.3.2.1基因组DNA提取 采用日本富士DNA提取试剂盒提取基因组DNA，严格按说明书操作，紫外分光光度计检测OD26010D280，以确定DNA浓度及纯度，将提取好的DNA置于-20℃冻存备用。

1.3.2.2 PCR-SSP 采用天津秀鹏生物技术有限公司的RhD基因检测试剂盒，扩增参数为96℃ 2 min，1个循环；96℃20 s 68℃ 1 min，5个循环；96℃ 20 s 65℃ 50 s 72℃ 45 s，18个循环；72℃ 5 min，1个循环；4℃保存。

1.3.2.3电泳及结果判读 将上述扩增产物5～10 ul转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中，140～150V电泳，10 min后于Alphaimager凝胶成像系统下观察结果。865 bp为内参带，另一条为特异性扩增带，有特异性扩增带判断为阳性，无特异性扩增带判断阴性。

2结果

130例RhD阴性标本中，经PCR-SSP方法检测，10例1227DEL型，119例RhD-CE（2-9）-D型，1例弱D15型。

3讨论

Rh血型基因位于人类第1号染色体断臂34.3～36.1区域。由RhD基因和RhCE基因紧密串联排列组成。RhD基因和RhCE基因高度同源（93.8%）均有10个外显子和9个内含子，长度分别为57932 bp和58575 bp，均编码417个氨基酸。两者的第8个外显子完全相同，差异较大的是外显子3、4.5、7、9和内含子。

RhD抗原表型除了正常的D阳性和阴性表型外还存在多种D变异表型。这种RhD变异体的形成涉及复杂的分子生物学变化，主要为RhD和RhCE等位基因发生融合、细胞外环错义突变，外显子缺失和等为基因被错换等。D变异体主要包括弱D（weakD）、部分D（partialD）和DEL型。弱D抗原表达完整但是强度减弱，由基因编码区碱基突变造成。中国人群中最为常见的是弱D15。此外，亚洲人群中还分布弱D1型、弱D24型、弱D6型。弱D12型和弱D17型等。部分D抗原表达不完整，其质量发生变异，与某些抗D试剂不发生凝集反应。中国人群中弱D以RhD-（2-9）-D2等为基因为主。DEL表型比例较高。各种族人群DEL表型的分子机制也不尽一致。中国人DEL分子机制主要有外显子9缺失和RhD1227A两种。

本研究通过对130例Rh阴性标本同时进行血清学检测结果均为Rh阴性，但基因学结果却有一定的差异，其中检出10例1227DEL型，119例RhD-CE（2-9）-D型，1例弱D15型.。由此可见，血清学检测Rh血型的方法快速简便，但确实存在一定的漏检率。为了避免在血清学上RhD变异体被误定为RhD阴性，采用DNA分型技术来鉴定这些D变异体变得越来越重要。比如血清学鉴定为RhD阴性，但基因型确为Rh阳性的血液，当输血时，输注给Rh阴性的个体，就会刺激机体产生RhD抗体，当混着再次输注Rh阴性血液时，就会出现输血反应。对于RhD阴性女性患者，输注这种血液，怀孕后发生新生儿溶血病的风险也随之增大。

综上所述，对血清学检测的RhD阴性标本进行RhD基因型检测势在必行，在不久的将来，相信随着科研和技术手段的进步，RhD基因分型方法将不断完善，对溶血性输血反应和新生儿溶血病等输血相关疾病的預防定会有长足的发展[1-3]。

参考文献：

[1]刘纯，刘伟.天津地区RHD阴性人群基因多态性分析[J].广东医学，2012，10，33（20）：3088.

[2]欧阳福桂，刘芳，王长奇.3种RH血型抗原检测在输血中的应[J].江西医药，2012，2，47（2）：177.

[3]邵超鹏.RHD研究进展和中国人RHD研究现在分析[J].中国输血杂志，2003，16（6）：354-357.编辑/丁一