安徽地区羊口疮病毒VIR基因PCR检测及遗传进化分析

侯宏艳，惠文巧，张丹俊，赵瑞宏，胡晓苗（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031）

安徽地区羊口疮病毒VIR基因PCR检测及遗传进化分析

侯宏艳，惠文巧，张丹俊，赵瑞宏，胡晓苗
（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031）

采集安徽某地区两个山羊场中疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料，采用PCR方法对毒力基因VIR进行了扩增，并获得了目的片段VIR-1和VIR-2。同时将PCR产物克隆至pMD18-T载体，鉴定后测序。序列分析结果表明，两个羊场的毒力基因VIR-1和VIR-2基因片段与参考毒株的相关基因核苷酸同源性分别为95.8%～100%和95.4%～99.6%。基因进化树比较显示，两分离株分别与美国AY424975.1株和甘肃KF916586.1株的亲缘关系最近。

安徽；羊口疮病毒；VIR基因；遗传进化分析

羊口疮病毒（orfvirus，ORFV）属于痘病毒科、副痘病毒属，绵羊和山羊感染后可引起急性、接触性、嗜上皮性传染病，临床表现为羊的口唇、舌、鼻、乳房等部位开始出现红疹，进而发展为丘疹、水泡、脓疱，最后形成结痂，以增生性炎症为典型特征［1］，多种野生动物和人也会感染ORFV而形成持续性感染，大羊多为隐性感染，有临床症状者多为6月龄以下的羔羊，有15日龄羔羊发生羊口疮的报道。发病羔羊因口唇溃烂而采食困难，严重影响生长发育，也易继发其他疾病，因此，羔羊病死率高达20%～50%［2］。羊口疮存在于大部分养羊国家［1］，如澳大利亚、新西兰、意大利、印度，韩国等。我国新疆、甘肃、内蒙古、陕西、四川、福建等多个养羊省区均有该病发生和流行情况的报道。

羊口疮病毒基因组中的干扰素抗性蛋白（interferon resistance protein，VIR）基因是一种主要保守型毒力基因，是干扰素抑制基因，可抑制干扰素的抗病毒效应［3-4］。在对羊口疮流行病学调查和抗原性研究方面常常对VIR基因进行研究［5-6］。2015年2月—2015年10月，安徽省某地区两个山羊场发生疑似羊口疮病，为了快速诊断病因，笔者等采用PCR方法对羊口疮病毒VIR基因进行检测，并对流行病毒的部分基因进行了遗传分析，以探明这两个羊场中羊口疮病毒的流行情况。

1 材料与方法

1.1 病料的采集与处理

2015年2月—2015年10月在安徽某地区两个羊场采集1～4月龄疑似发生口疮病羔羊的唇部痂块，用无菌0.01mol/L（pH 7.2）PBS液漂洗数次后剪碎、研磨，用无菌PBS液按体积比为1∶5制成悬液，加青霉素、链霉素各2 000U/mL，置4℃冰箱过夜，以5 000 r/min离心10min，取上清液置-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

病毒总DNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、pMD18-T载体和DL 2000Marker等均购自天根生化公司。

1.3 引物

根据GenBank中VIR基因序列，用PrimerPremier5.0软件设计引物，由上海生物工程有限公司合成。依据VIR基因设计的引物序列如下：P1 5'-TTGCTGCGAGGACGGAAACCCG-3'；P2 5'-TGCAGGTGAAGCGCGGACAGTG -3'，预期扩增目的片段大小为284 bp。

1.4 DNA提取及PCR检测

取1.1中保存的上清液，用病毒总DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作按说明书进行。以提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）：2× Taq mix 12.5μL，ddH2O 8μL，25μM的上下游引物各1μL，DNA模板2.5μL。PCR反应条件：95℃变性4min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共33个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳。

1.5 目的基因的克隆与测序

采用DNA凝胶回收试剂盒对回收的目的DNA进行纯化，纯化的PCR产物与pMD 18-T载体连接，构建重组质粒，转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，200 r/min振荡培养过夜。提取重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳、PCR方法鉴定正确的阳性重组质粒，并进行序列测定。

1.6 遗传进化分析

利用DNAStar软件将测定结果与国内外的参考毒株进行序列同源性分析，并构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

将病毒基因组的PCR扩增产物（图1）克隆于pMD 18-T载体中，通过琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定，均得到一致结果。鉴定正确的重组质粒进行测序，结果证实插入的DNA片段大小为284 bp。

图1 羊口疮病毒VIR部分基因PCR扩增结果

2.2 序列比较与分析

利用DNAStar软件将测序结果与Gen Bank中登录的Orf病毒不同毒株的VIR序列进行比较分析（图2）。结果表明，两个羊场的毒力基因VIR基因片段与参考毒株的相关基因核苷酸同源性分别为95.8%～100%和95.4%～99.6%，证明该基因较为保守。

图2 不同羊场VIR部分基因序列分析

2.3 遗传进化关系

将两个羊场VIR基因片段与国内外发表的毒株相应片段作序列比较，应用软件绘制系统进化树（图3），结果显示，VIR-1和VIR-2在一个大的分支中，VIR-1与美国AY424975.1株的亲缘关系较近，而VIR-2与甘肃KF916586.1株的亲缘关系较近。

图3 不同羊场VIR部分基因遗传进化树分析

3 讨论

羊口疮病毒能够编码一系列抗炎性因子（如VIR），以阻止病毒感染细胞发生凋亡而产生免疫逃避，该病毒已被证明为一种变异较强的病毒，各地病毒在感染性、致病性上存在较大差异［7］。目前，安徽地区羊口疮的诊断和序列分析鲜见报道，掌握安徽地区羊口疮流行病毒病原分子特性有重要意义。因此，本试验对发病的2个山羊场首先进行了羔羊口疮的临床症状诊断［6］，取疑似羔羊口疮痂块进行了PCR检测，将扩增序列进行比较后，可判定为羊口疮病毒阳性。本研究采用PCR快速直接诊断，省去了电镜观察或细胞培养过程，从而便于临床诊断和流行病学调查研究。本试验还分析了VIR部分基因的遗传进化情况，结果与参考序列的同源性都在95.4%以上，虽然VIR-1和VIR-2在一个大的分支中，但VIR-1与美国AY424975.1株的亲缘关系较近，VIR-2与甘肃KF916586.1株的亲缘关系较近，推测安徽流行株可能是由几个毒株重组后产生的。

近年来，安徽省养羊业发展迅速，规模化羊场数量快速增加，由于ORFV弱毒疫苗存在安全隐患以及使用效果的不确切性，很多养羊场不进行ORFV的疫苗免疫，羊口疮已成为安徽省养羊业的主要疫病之一。如果羊场内羔羊发病率高，建议母羊产前1个月和羔羊出生后10 d进行疫苗注射免疫［8］，并从饲养管理、营养、消毒、疫苗等多方面进行综合防控。

［1］De la Concha-Bermejillo A，Guo J，Zhang Z，etal.Severe persistentorf in young goats［J］.Vet Diagn Investigat，2003，15：423-431.

［2］Hosaman iM，Scagliarini A，Bhanuprakash V，et al.Orf：an update on current research and futureperspectives［J］.Exp Rev AntiinfectTher, 2009，7（7）：879-893.

［3］Haig D M,McInnesC J，Thomson J，etal.The orfvirus gene OV20.0L gene product is involved in interferon resistance and inhibits interferon-inducible double-stranded RNA-dependent kinase［J］. Immunology，1998（93）：335-340.

［4］Kottaridi C，Nomikou K，T eodori L，et al.Phylogenetic correlation of Greek and Italian orf virus isolates based on VIR gene［J］.Vet Microbio1，2006，116（4）：310-316.

［5］郭良兴，赵魁，赵广海，等.吉林省2006—2010年羊传染性脓疱病的流行病学调查及分析［J］.中国兽医学报，2011，31（11）：1623-1626.

［6］李杰，李前瑞，田婷婷，等.羊口疮病毒B2L和VIR基因原核表达及抗原性鉴定［J］.动物医学进展，2013，34（3）：1-6.

［7］向智龙，程振涛，卓建华，等.羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用［J］.贵州农业科学，2010，38（7）：145-147.

［8］刘文进，陶金林，唐燕，等.新疆塔额垦区羊口疮诊断与综合防控［J］.畜牧与兽医，2015，47（3）：106-108.

PCR Detection and Phylogenetic Analysisof OrfVirus in Anhui Province

Hou Hongyan，Hui Wenqiao，Zhang Danjun，et al
（Institute of Animal Husbandryand Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei 230031，China）

The kid lacrimal scabs were collected from two farms in Anhui Province for amplifying the VIR gene by PCR method. Successfully，the target gene were got，and named VIR-1，and VIR-2，respectively.Then，the PCR productwas inserted into pMD18-T Vector，then identified and sequenced.The sequence analysis showed that the nucleotide sequence homology of VIR-1 and the referenced gene was 95.8%-100%，while the nucleotide sequence homology of VIR-2 and the referenced gene was 95.4%-99.6%.The results of phylogenetic tree showed that they were the closest to AY424975.1 strain and KF916586.1 strain respectively.

Anhui；ORFV；VIR gene；genetic evolution analysis

S827.2

A

2095-3887（2017）01-0004-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.002

2016-12-01

国家自然科学基金（31402048）；安徽省农业科学院学科建设项目（16A0413）

侯宏艳（1975-），女，助理研究员，硕士，主要从事动物病原学研究。通信作者：张丹俊，研究员，主要从事畜禽传染病学研究。