内质网应激与非酒精性脂肪性肝病研究进展

曹洁，姚隆(重庆市江津区中心医院消化科、重症医学科，重庆4060)

内质网应激与非酒精性脂肪性肝病研究进展

曹洁1，姚隆2(重庆市江津区中心医院消化科1、重症医学科2，重庆402260)

非酒精性脂肪性肝病是目前临床上最为常见的慢性肝病之一，其病因及发病机制相当复杂，至今尚未完全阐明。目前认为，内质网应激与非酒精性脂肪性肝病的发生和进展密切相关。内质网应激是一种生理反应，反映的是细胞对应激进行抵抗的现象，但是，过度的应激能够损害细胞。本文叙述了内质网应激与胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、氧化应激和脂质过氧化、肝细胞凋亡等四部分内容，并提及了炎性反应，主要阐述内质网应激在非酒精性脂肪性肝病发病中的作用。

内质网应激；非酒精性脂肪性肝病；胰岛素抵抗；脂质代谢；氧化应激；凋亡

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种多病因的复杂性慢性肝脏病变，属于代谢应激范畴。其发病的原因包括两方面，一方面是患者体内的胰岛素产生抵抗作用；另一方面是遗传易感性。在代谢综合征中，NAFLD是一个非常重要的组成部分。肥胖症以及糖尿病和血脂紊乱等是NAFLD发病的重要危险因素。其疾病谱包括4个阶段：单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和隐源性肝硬化。在临床诊断上，通常通过影像学和组织学分析，如果发现肝细胞脂肪病变，在排除患者没有遗传性疾病、没有服用相关药物以及不存在摄入大量酒精的情况下，就可以确诊[1]。

随着社会生活水平的提高、生活方式的改变，NAFLD发病率呈逐年上升及低龄化趋势，然而，NAFLD的病因和发病机制尚未完全明确。经典的NAFLD发病机制是“二次打击”学说，“第一次打击”是以胰岛素抵抗为中心而导致的肝脏脂肪变，“第二次打击”则是由于肝内甘油三酯储存过量而导致的脂质过氧化和氧化应激等[2]。然而，经典的“二次打击”学说并不能完全解释由NAFL进展为NASH甚至肝纤维化等更严重的阶段。因此，国内外学者在“二次打击”学说的基础上更加重视“内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)”在NAFLD发生发展中的作用。

在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)是一个非常重要的细胞器，其主要与蛋白的加工成熟、钙离子储存、脂代谢和细胞的解毒活动有密切联系，大量存在于肝细胞当中，使肝细胞的正常功能得以发挥。因此，其状态是否稳定，对于肝细胞来说至关重要。有多种因素能够导致肝脏发生病变，这些因素首先可能会损害ER，使其无法正常工作，引起内质网应激，其发生的途径包括未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)和非UPR信号通路：

UPR是机体内部的蛋白质，在致病因素的作用下发生错误折叠，从而引发内质网应激。UPR信号途径有3条，分别为激活转录因子6(ATF6)、需肌醇酶1/X盒结合蛋白1(IRE1/XBP-1)、RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶/真核细胞翻译起始因子2α(PERK/eIF-2α)。内质网应激时，UPR通过抑制蛋白合成、促进未折叠蛋白加工成熟和水解错误折叠蛋白减轻ER蛋白负荷并促进细胞重建ER稳态[3-5]。非UPR包括细胞核转录因子κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MEK/ERK)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)等[6-10]。

内质网应激是一种生理反应，反映的是细胞对应激抵抗的现象。但是，过度的应激能够损害细胞。国内医学界近年对内质网应激进行了大量的研究，主要聚焦其在代谢综合征中的作用[11]，根据大量的研究成果，人们发现其和NAFLD的发生以及转归有直接的联系[12-13]，因此，本文从以下几个方面阐述内质网应激在NAFLD中的作用：

1 内质网应激与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)

IR指的是由于胰岛素正常的促进作用减弱，导致人体无法正常吸收和利用葡萄糖，在这种情况下，机体代偿功能就会分泌大量的胰岛素，造成高胰岛素血症，从而保持患者体内血糖的稳定。越来越多的研究证明，糖尿病是NAFLD发生发展的高危因素，2型糖尿病患者在NAFLD的发展过程，即NASH的形成、肝纤维化和肝细胞癌方面有较高的风险，其肝脏疾病相关的死亡率也很高[14-15]。我国的医学界也进行了这方面的临床研究，将NAFLD组和正常组进行对照，发现前者在稳态模式下，胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著的增加[16]。

当下的医学界一致认为，IR通过作用于肝细胞，使胞内的脂质大量沉积，从而引发NAFLD。同时，单纯性脂肪肝在IR间接作用下，会加快转变为NASH，甚至形成肝纤维化。所以，正确理解IR的诱发因素以及其基本特征，在临床治疗上非常重要。

大量的临床实践提示，内质网应激与IR的发生有重要的关系，尤其是在肝脏、脂肪等外周组织中[17]。胰岛素信号通路：首先，胰岛素分泌物进入酪氨酸激酶，使其呈现活化状态，其底物-1(IRS-1)也随之发生酪氨酸磷酸化作用。国外学者Ozcan等[18]采用毒胡萝卜素进行诱导的方法对此展开研究，建立肝细胞内质网应激模型。研究结果表明，内质网应激阻碍了胰岛素受体的信号通路，因为在这种环境下，JNK依赖性的丝氨酸磷酸化增加，而IRS-1的酪氨酸磷酸化减弱；研究人员采用SP600125抑制JNK信号通路，内质网应激的阻碍作用明显减弱。以上研究结果说明，内质网应激通过促进IRS-1丝氨酸磷酸化，阻碍胰岛素的受体信号通路，使人体葡萄糖的吸收和利用受阻，从而引起IR。这些学者的研究还发现，内质网应激条件下的IR受XBP-1过度表达的抑制，在后者的作用下，胰岛素的信号传导得到改善，已在体内和体外实验中得到证实[18]。Nakatani团队的研究证明，肝脏中内质网应激水平，受到ER分子伴侣-氧调节蛋白150(oxygen related protein 150，ORP150)过度表达的抑制，在后者的作用下，胰岛素信号有了明显的增强，IR和糖耐量均有了较大的改善[19]。由以上的研究结果可以得知，在IR的发生过程中，内质网应激是至关重要的因素，其涉及的具体致病机制，目前医学界还没有明确的结论。

2 内质网应激与肝脏脂代谢紊乱

目前，医学界还没有完全明确NAFLD的发病机制，但其产生和发展的基础是肝内脂质异常聚集，特别是游离脂肪酸和甘油三酯。虽然部分学者已经证实，这种肝脏脂质代谢紊乱与内质网应激有直接的关系[12-13]，但其涉及的具体机制尚无定论。

国外学者Oyadomari等[20]以过表达DNA损伤诱导基因34(GADD34)的小鼠为研究对象，证实在高脂饮食诱导小鼠发生脂肪性肝病的过程中，PERK/eIF-2α信号通路发挥了促进作用。Mori等[21]学者通过对小鼠体内研究证明，ATF6信号通路能够减轻肝细胞脂代谢紊乱。此外，用胰岛素诱导的C57BL/6小鼠作为研究对象，发现其原代肝细胞中的IRE1/XBP-1通路激活生脂基因SREBP-1c和FAS，进而引起肝细胞脂质代谢紊乱[22]。我们课题组在毒胡萝卜素诱导的L02和HepG2肝细胞的实验中证实，细胞内的粗面内质网出现膨胀及脱颗粒，发生内质网应激；同时胞内甘油三酯的含量显著升高、有明显的脂滴聚积。毒胡萝卜素刺激后内质网应激伴侣蛋白GRP78、脂质合成的关键基因SREBP-1c及其下游的FAS、ACC的表达升高[23]。上述研究均说明，在肝细胞脂代谢过程中，内质网应激UPR信号通路起到了调控的作用。

通过上述多项研究，在肝脏发生脂肪病变的过程中，内质网应激是主要的因素，其通过干扰作用，导致肝脏的脂质代谢异常。但是，部分研究却证明，这种作用是相互的，即脂质过度沉积会诱发内质网应激。宁波团队的细胞实验结果证实，人肝细胞(L02和HepG2)被饱和脂肪酸软脂酸钠诱导12 h，内质网应激标志蛋白GRP78和C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)表达开始增加[24]。研究人员对高脂喂养的NASH小鼠进行研究，小鼠体内的UPR被激活，而且UPR参与损害NASH肝细胞[25]。国外有研究人员对11例肥胖人员进行研究，对他们进行了胃旁路手术，对比手术前后的状况，发现术后体重下降明显，体内脂肪和肝脏组织中内质网应激蛋白GRP78、XBP-1和磷酸化eIF-2α的表达均有明显下降，IR改善，糖耐量也有了大幅度的提高。这项研究结果提示，肥胖可以诱发内质网应激，其原因可能是代谢异常[26]。上述研究均表明脂质沉积是内质网应激发生的诱因。所以，脂代谢异常和内质网应激两者互相作用，在NAFLD的发病与转归过程中，都发挥了至关重要的影响。

3 内质网应激与氧化应激

氧化应激是机体产生ROS等活性物质的能力与细胞消除的能力失衡造成的细胞损伤，而肝脏是解毒和抗氧化的主要场所。“二次打击学说”认为：肝脏在氧化应激的作用下，细胞活跃程度增加，炎性细胞因子大量释放，引起肝细胞发生炎症，形成NASH。如果NASH长期存在体内，就会逐渐加重肝脏的炎症，细胞坏死，最终发展成为脂肪性肝纤维化和肝硬化[2]。ER能够促进氧化环境的形成，从而使蛋白发生氧化，然后产生折叠。在这个过程中，大量的二硫键形成，这些二硫键又会产生相应数量的ROS。所以，ER和上述三者有着直接的联系[27]。氧化应激对内质网应激有着双重的作用，既诱导其发生，又是促进其损害细胞的活动。通过对软脂酸钠诱导的脂变肝细胞的研究，发现胞浆中氧化反应产物(丙二醛和氧化型谷胱甘肽)含量增多，在细胞的上清液中，转氨酶含量也在上升，可见较多细胞凋亡，并且GRP78和CHOP表达增加。研究人员使用抗氧化剂对谷胱甘肽的活动进行干预，抑制了GRP78和CHOP表达，转氨酶和丙二醛的含量较前均有降低。以上研究结果显示，氧化应激可能通过内质网应激介入脂毒性，损害肝细胞[24]。

内质网应激如果长期存在机体内，会促进ER腔储存的钙离子向外渗透，损害线粒体，诱发氧化应激，激活NF-κB信号通路，细胞凋亡，引起肝脏发生炎症反应。国外的一项研究证明，内质网应激在反应过程中，PERK/Nrf2通路被激活，沉默PERK或Nrf2基因后，还原型谷胱甘肽水平下降，ROS水平明显增加，细胞凋亡数量增多，说明细胞在氧化应激的状态下，对内质网应激诱导的病理反应的敏感性提高，PERK/Nrf2通路在其中起到了调控氧化的作用[28-29]。最近的研究显示，在内质网应激信号通路中，对抗氧化进行调控的还有IRE1/XBP-1途径[30]。当下，医学界并无明确的研究结论，但上述研究证明氧化应激既是内质网应激发生的诱发因素，又是内质网应激导致细胞损害的重要环节。

4 内质网应激与细胞凋亡

长期以来，医学界对细胞凋亡展开了大量的研究，这些研究都指向一个事实，即肝细胞凋亡推动着NASH的发生和发展。将NASH组大鼠和正常组进行比较，发现前者的肝细胞凋亡数量明显高于后者，凋亡相关蛋白表达发生改变[31]。在体内实验的研究中发现，NASH患者肝组织中细胞凋亡率明显高于正常对照组，并且肝细胞凋亡率随着病理组织学的严重程度而增加[32]。所以，在NASH的发生和进展过程中，凋亡是一个重要特征，其发生机制并不明确。

最近的研究发现除死亡受体活化和线粒体损伤之外的新的细胞凋亡信号传导通路，即强烈持久的内质网应激会引发细胞凋亡[4]，同时也有研究证明，内质网应激能够造成NASH肝细胞损害。对高脂喂养NASH小鼠的研究显示，UPR被激活，并且引起NASH肝细胞凋亡[24]。研究人员通过对NASH患者的肝脏组织检测，发现UPR分子被激活，并且肝细胞凋亡增加[33]。我们的研究小组通过对L02和HepG2细胞的研究证实，饱和脂肪酸作用肝细胞12 h、24 h、48 h，GRP78、磷酸化PERK、ATF4和CHOP蛋白的表达呈时间依赖性增加，并且肝细胞大量凋亡。这说明，UPR信号通路PERK/ATF4/CHOP被激活，阻断该通路可以部分抑制肝细胞凋亡[34]。上述实验结果表明，内质网应激UPR与NASH发生过程中肝细胞凋亡密切相关。

医学界在涉及内质网应激领域时，主要集中在UPR方面，较少研究非UPR，后者逐渐引起当下学者的关注[7]。国外学者以肝癌细胞株Huh7和Hep3B为研究对象，饱和脂肪酸作用后内质网应激蛋白明显上调，GSK-3被激活，敲除GSK-3基因，内质网应激蛋白表达无变化，脂肪变性肝细胞凋亡明显下降，表明在饱和脂肪酸诱导的肝细胞脂毒性凋亡中，GSK-3是重要的信号途径[9]。我们课题组在体外实验中初步证实PI3K/Akt通路可能参与了饱和脂肪酸诱导脂变肝细胞中内质网应激UPR和非UPR信号途径的调控，抑制PI3K/Akt可能通过促进CHOP和Bax蛋白的表达从而促进饱和脂肪酸对肝细胞的脂毒性、促进肝细胞凋亡[35]。目前有关非UPR与NASH肝细胞凋亡的报道较少，缺乏体内和动物实验的研究，但现有的研究结果初步表明NASH肝细胞凋亡受到非UPR信号途径的作用。

除此之外，在NAFLD的发生、发展过程中，炎性反应不但是NASH的一个重要特征，而且是一个重要的推动因素，促进肝纤维化的发展进程。内质网应激能够通过多个途径诱发炎性反应，并且作用广泛，通过直接或间接的作用，损害肝细胞，造成肝纤维化发生[36-37]。所以，在NAFLD发病过程中，内质网应激相关炎性反应也是一项重要机制。

综上所述，NAFLD的发病机制十分复杂，内质网应激在NAFLD的进展中起到了非常重要的作用，对肝细胞胰岛素抵抗、脂质代谢、氧化应激和肝胞凋亡发挥着重要的影响。随着NAFLD病程的发展，也激活了内质网应激，加剧了疾病的进程。但是目前对NAFLD发病机制中，关于内质网应激的研究，主要包括两部分，一是体外实验，二是动物实验。尽管有极少的体内实验，但没有足够的实验证据。因此，研究结果并没有足够的说服力，无法作为NAFLD发病机制的定论；同时，在内质网应激的初始阶段，进行有效的干预治疗，能够保持ER状态的稳定。如果长期存在，应激程度加剧，就会导致患者出现多种病理性反应。因此，我们应该关注干预的环节，对各种调控因素进行深入的分析。但是，截至目前，人们仍然还没有完全掌握内质网应激信号通路的各个环节，对这些问题进行探索，能够从整体上剖析内质网应激信号通路的生理学功能，给出不同病理时期的干预方案，能够对NAFLD的发病机制进行更加深入的阐述，对NAFLD患者进行更加准确的诊断，找到更加有效的治疗方法。

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Progress in research of endoplasmic reticulum stress and nonalcoholic fatty liver disease.

CAO Jie1,YAO Long2, Department of Gastroenterology1,Department of Intensive-Care Medicine2,Chongqing Jiangjin District Central Hospital of Chongqing,Jiang jin,Chongqing,402260,CHINA

In clinic,nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)is one of the most common liver disease.However,the pathogenesis of NAFLD is considerably complicated and is still poorly understood to date.The current studies suggest that endoplasmic reticulum stress is closely associated with the development and occurrence of NAFLD.Endoplasmic reticulum stress is not only the physiological responses of cell to resist stress,but also an important mechanism of cell injury caused by stress.Here in,we discuss endoplasmic reticulum stress and the effects on insulin sensitivity,lipid metabolism,oxidative stress,lipid peroxidation,apoptosis and inflammation,and investigate the role of endoplasmic reticulum stress in the pathogenesis of NAFLD.

Endoplasmic reticulum stress;Nonalcoholic fatty liver disease;Insulin resistance;Lipid metabolism;Oxidative stress;Apoptosis

R575.5

A

1003—6350（2017）14—2341—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.032

2017-01-05)

重庆市卫生局重点课题(编号：2012-1-033)

曹洁。E-mail：840331cj@163.com