MicroRNAs调控机制及检测方法的研究进展

梁洁玲,王洋洋,司艳辉,李海珠,陈立强

(肇庆市第一人民医院,广东 肇庆 526060)

MicroRNAs(miRNA)是由18-22nt组成的非编码RNA,其在基因表达过程中发挥调节作用。随着序列检测技术的提高,对miRNA的研究亦进一步深入,而新颖的miRNA合成技术开展也加深了我们对miRNA的认识[1]。许多研究机构已经报道miRNA在癌症、糖尿病、心脏病和自身免疫性疾病中均发挥调节作用,而且miRNA在多种体液中存在,包括血浆、血清、尿液、精液和唾液等；对体液miRNA进行检测可对某些疾病的诊断和药物治疗提供更科学的依据,故miRNA可作为某些疾病的诊断标记物并推广应用[2]。此文针对miRNA调节机制及近期检测方法进行综述,以了解miRNA的检测方法的最新进展。

1 miRNA简介

真核细胞基因表达的传统中心法则是DNA转录mRNA,再由mRNA翻译为蛋白质。自从miRNA被发现,让我们对RNA的生成和调控机制有了新的认识。miRNA是微小(21-22nt)的RNA,其功能主要是调节基因表达和蛋白质的生物合成[3]。miRNA可通过识别mRNA的特定序列,抑制多种类型的mRNA转录和影响蛋白质的合成。通过对miRNA的功能研究发现,miRNA的调控错误会影响多种基因表达,最终导致疾病的发生。miRNA主要来自其靶基因的基因序列之间或基因内区,这类miRNA与靶基因共同转录,再识别细胞内环境的状况对靶基因进行调控,达到细胞内环境平衡[4]。某些miRNA前体是由蛋白编码基因或非蛋白编码基因序列内区转录生成,或者来源于非蛋白编码基因RNA的外显子序列,因此该类miRNA的表达主要作用于其靶基因。另外有部分miRNA主要作用于启动子序列的多顺反子区域,在miRNA修饰成熟过程中保持多种类型的茎环结构[5]。

2 miRNA生成与调控机制

miRNA的生成需要多种蛋白酶,pri-miRNA的剪切须RNAse III Drosha和DGCR8(一种双链RNA结合蛋白),这种蛋白复合物是由大约70nt核苷酸组成的茎环结构的pre-miRNA,pre-miRNA的3’和5’磷酸末端向外伸展,形成独特的茎环结构[6]；这时pre-miRNA通过Exportin-5(一种Ran-GTP依赖蛋白)转运到细胞质中。pre-miRNA转运到细胞质后通过Dicer(RNAse III蛋白酶)剪切,同时与转运激活反应性RNA结合蛋白(transactivation Response RNA-Binding Protein,TRBP)形成联合体[7]。此时pre-miRNA的茎环结构会解开并且3’末端会伸出约22nt的RNA双链结构,Dicer将此RNA转运至Ago(Argonaute)蛋白并相互结合,构成RNA诱导沉默复合物(RNA-Induced Silencing Complex,RISC)；此时该RISC是前体RISC,要形成成熟的RISC还需进行该RNA双链的分离,该过程称为RNA的链分选过程。RNA的链分选过程主要由热力学因素决定,主要取决于RNA双链的前面4个核苷酸分子。因此,首先末端分离的RNA单链作为向导链生成miRNA复合物,而随从链会被分解处理。细胞质中成熟的RISC复合物可寻找与miRNA序列相匹配的mRNA,miRNA与mRNA根据Watson-Crick法则进行配对结合,结合区域是mRNA的3’未翻译区域(untranslated region,UTR ) 与miRNA的“种子序列”(即miRNA第2-8的核苷酸序列)[8]。miRNA不一定都是以DNA序列作为模板,有6%的人体miRNA以RNA作为模板进行编辑。此外,单独的pre-miRNA可以生成多种成熟的miRNA,每种miRNA序列的长度和核苷酸顺序均不相同,该类型的miRNA称为isomiRNA。这种miRNA的编辑可改变“种子序列”的结构,从而改变miRNA与靶向mRNA的识别,此机制讲改变miRNA对靶基因的选择。细胞内不同类型的isomiRs表达会影响不同蛋白的表达,miRNA的类型和数量均能影响该细胞的生理功能,若miRNA的生成以及表达发生异常,会直接导致细胞和组织的内部功能紊乱[9]。沉默mRNA可使mRNA降解或抑制其表达,miRNA与mRNA匹配结合后,通过Ago酶作用对mRNA进行剪切,而如果miRNA与mRNA不是完全匹配,则会抑制mRNA的表达,对蛋白质翻译的过程产生抑制机制[10]。

3 miRNA检测

3.1 实时定量PCR测定miRNA

由于miRNA序列较短,难以利用其有效的特异性引物和探针对其进行实时定量PCR检测,而有些学者利用较长的pre-miRNA作为把序列进行检测,但pre-miRNA的检测不能真实反映miRNA的表达水平[11]。现在的解决方法是设计一种茎环状的PCR引物对miRNA进行逆转录,然后对cDNA再进行实时定量PCR检测。RT-PCR引物的设计有2种类型,一是有Oligod(T)特异的RT引物,该引物包含与miRNA互补序列加上约20个左右的Oligod(T)结构；二是茎环状结构的RT-PCR引物,由可以形成特异性环茎状的特异序列的6-8个与miRNA3’端反向互补碱基构成,一个茎环状结构的RT引物与一条miRNA序列特异引物相互对应。两种引物各自有其优点,Oligod(T)特异的RT引物设计简单而且检测通量高,而茎环状结构的RT-PCR引物的灵敏度和特异性比前者高[12]。

3.2 生物芯片测定miRNA

生物芯片检测miRNA的技术路线主要包括了样品RNA的准备、生物芯片的预处理、芯片的扫描及数据读取和最后的数据分析。生物芯片经杂交后,数据通过荧光检测设备检测荧光的强度,芯片上的每一个杂交点都是单一的miRNA杂交信号,通过设备精细读取芯片的信息,可以获取这些杂交信号的相对表达强弱[13]。随后将芯片探针类型与数据库探针类型进行同步处理,读取杂交的信号进行预处理,各个探针的表达水平形成数据再与特定基因的表达进行背景校正,多种样品进行比较和数据整合,最终得到miRNA的相对表达量。通过不同的实验设计与多样的统计手段,可做反映miRNA或者甲基化的区域的相关研究。随着miRNA芯片技术的发展,可进行miRNA靶基因的预测,或利用分析软件对相关基因进行功能分析；根据数据库信息整合,发现新的生物信号和代谢通路。因此,大数据库的整合利用可完成miRNA-miRNA表达相关性分析,miRNA-靶mRNA表达相关性分析和对miRNA功能推导,从而得到异常miRNA参与的生物学过程[14]。

4 结语

综上所述,miRNA对转录后调控产生重要的调控作用,miRNA与mRNA结合而抑制其翻译过程。研究发现大部分病理过程均出现miRNA表达异常,故miRNA可作为某些疾病的标志物进行检测,更深入的研究miRNA的功能和特征、检测方法的更新为其作为诊断手段提供更合理的素材。因此,miRNA可作为疾病诊断和预测的新的标志物,而诊断标准和诊断数据的整合,标本的处理和保存,技术流程的规范对miRNA成为诊断标志物至关重要。

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