云南德宏地区一例虎纹蛙气单胞菌的分离鉴定

2017-02-25张瑞海赵汝梅张书光

中国畜牧兽医文摘 2017年1期

关键词：盈江县德宏单胞菌

张瑞海赵汝梅张书光

(1.盈江县动物疫病预防控制中心，云南盈江 679300；2.德宏州动物疫病预防控制中心，云南芒市 678400；3.昆明理工大学津桥学院，云南昆明 650101)

云南德宏地区一例虎纹蛙气单胞菌的分离鉴定

张瑞海1赵汝梅3张书光2*

(1.盈江县动物疫病预防控制中心，云南盈江 679300；2.德宏州动物疫病预防控制中心，云南芒市 678400；3.昆明理工大学津桥学院，云南昆明 650101)

目的：确诊虎纹蛙的致病菌。方法：采用平板分离法从死亡虎纹蛙肝脏中分离出1株细菌，通过表型、16s-rRNA的PCR扩增、测序鉴定。结果：分离菌的测序结果为气单胞菌，16s rRNA序列同源性分析结果表明分离菌与气单胞菌的同源性为99%。结论：虎纹蛙所患细菌病为胃肠炎，细菌病原为气单胞菌。

气单胞菌分离鉴定 16s-rRNA

虎纹蛙（Rana tigrina Wiegmann）隶属于两栖纲无尾目蛙科蛙属，广泛分布于中国、印度、尼泊尔、锡金、孟加拉、斯里兰卡、泰国、印度尼西亚及菲律宾等热带和亚热带地区。虎纹蛙共有4个亚种，中国仅分布1 亚种，即虎纹蛙，目前已被列为国家二级保护动物，主要分布于我国东南和南部各省，河南和陕西南部也偶有分布。云南的陇川、盈江、勐腊、河口、金平、屏边、石屏和元江等地均有分布。

气单胞菌在细菌分类学上属于弧菌科（Vibrionaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是多种鱼类均可感染的病原细菌，且感染后的病型也表现很复杂，同时存在多种不同的免疫血清型。其中有的不仅可致鱼病，还可引起人的感染发病。陈怀青等报道嗜水气单胞菌引起鲤科鱼暴发性传染病，朱家新报道嗜水气单胞菌引起牛蛙暴发性疾病，韩名竹等报道嗜水气单胞菌引起甲鱼出血性败血症。近年来，有关气单胞菌引发养殖鳗鲡的细菌性败血症也多有报道，最常见的由致病性嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila引起的鳗鲡败血症表现为体表充血乃至溃烂、血性腹水、胃内积水、肠炎、肝脾等组织败血等系列严重病变，每年都能引起养殖鳗鲡的大批量死亡。

1 材料与方法

1.1 材料

病料由云南德宏某个体养殖户送检；细菌基因组DNA提取试剂盒（DP2001）和Ex tag酶购自大连宝生物技术有限公司。

1.2 引物

根据已知参比序列设计细菌通用引物，上游引物PF：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，下游引物PR：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’，扩增目的片段大小为1500bp左右，由大连宝生物技术有限公司合成。

1.3 菌株的分离与纯化

采取虎纹蛙的肝脏病料，涂布于LB平板上，置于恒温培养箱37摄氏度培养12～16h后观察细菌生长情况。挑取单个典型菌落，进行纯培养后分别进行革兰氏染色及菌种保存。

1.4 16s-rRNA鉴定

1.4.1 16s-rRNA测序

将分离菌株接种LB液体培养基中，37℃培养10h，用试剂盒按说明书方法提取基因组DNA。用细菌通用引物pF、pR、扩增16s-rRNA，PCR扩增体系为50μL，反应条件为95℃ 5 min；94℃30 S，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃ 10 min。扩增产物送到大连TaKaRa公司测序。

1.4.2 16s-rRNA测序结果比对

将测序结果提交至GenBank进行比对。下载同源性最高的序列，用本地软件DNAMAN将测序结果与下载序列进行同源性比对。