啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进

陈学周++毕意辉++张可可++张明凯++尤涛

摘 要：目的：通过对新生啮齿类海马神经元的分离和培养，尝试建立一个简单、稳定、高效的啮齿类海马神经元原代培养方法，为脊髓损伤的相关分子机制研究提供目的细胞。方法：取新生SD乳鼠的海马组织，通过低浓度胰酶消化制成细胞悬液、4h差速贴壁后使用无血清Neurobasal培养基培养，倒置显微镜观察细胞生长状态，免疫荧光对海马神经元相关微管蛋白-2（MAP2）行特异性染色，结合DAPI核染色鉴定神经元。结果：该方法培养的海马神经元生长状态良好，纯度较高。结论：采用低浓度胰酶消化，差速贴壁及无血清培养啮齿类海马神经元符合体外细胞实验要求，为进一步研究提供良好的目的细胞。

关键词：海马神经元；低浓度胰酶；差速贴壁；无血清培养

中图分类号 Q42 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）02-06-03

Culturing and Identification of the Neonatal Rodent Hippocampal Neurons

Chen Xuezhou1 et al.

（1 The Department of Orthopedics， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022，China）

Abstract：Obejctive：To established a simple， effective and stable method for the culture of rat hippocampal neurons in vitro， and provide target cell for dissecting molecular and cellular mechanisms in neuroscience.Methods：The hippocampus of neonatal rat were dissected and cell suspension were digested by low concentration of trypsin.The cell suspensions were cultured with serum-free Neurobasal medium after four hours differential adherence.Morphological observation of neurons growth state by inverted microscope， the hippocampal neurons can be identified by MAP2 specific antibody with DAPI.Results：The hippocampal neurons grew well and reached a high purity.Conclusion：Using low concentration of trypsin， differantial adherence and serum-free medium conforms to the requirements of neonatal rat hippocampal neurons culture in vitro， so as to provide targeted cells for further research.

Key words：Hippocampal neurons；Low concentration of trypsin；Differantial adherence；Serum-free medium

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是脊柱外科一种致残率很高的疾病，易造成患者运动功能障碍，大小便失禁甚至终身瘫痪[1]。现代研究表明，脊髓损伤后，经历第一次原发性损伤及第二次继发性损伤，二次损伤是继发性，是可以预防和治疗的，其重点在于保护残存神经元的功能[2]。建立简单、稳定、高效的神经元体外培养是在细胞水平研究脊髓损伤的重要物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 出生24h内SD乳鼠，雌雄不限，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 Neurobasal培养基、B27无血清添加剂、GlutaMAX-I添加剂、DMEM（high glucose）培养基、灭活胎牛血清、0.25%胰酶、台盼蓝染液均购自Invitrogen公司，多聚-D-赖氨酸、DPBS、Hanks液、抗荧光淬变封片液购自碧云天公司，DNase I、DAPI、Triton X-100购自sigma公司，神经元相关微管蛋白-2（MAP2）、Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L）购自abcam公司。

1.1.3 主要器材 24孔细胞培养板、15mm细胞爬片、超净工作台、细胞培养箱、激光共聚焦显微镜、手术解剖显微镜

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 种植培养液：含90%DMEM+10%灭活胎牛血清。维持培养液：98%Neurobasal培养基+2%B27无血清添加剂+0.5mMGlutaMAX-I添加剂。

1.2.2 细胞爬片及细胞培养孔板处理 将灭菌的15mm细胞爬片用DPBS配制的0.1mg/mL多聚-D-赖氨酸溶液浸泡，室温孵育2h，吸弃多聚-D-赖氨酸溶液，蒸馏水洗2遍，晾干待用。

1.2.3 海马神经元的分离 取出生24h内SD乳鼠，75%酒精消毒后断头，依次剪开皮肤、颅骨，迅速取出脑组织置于冰上含有预冷Hanks液的培养皿中。在手术显微镜下分离出两侧的海马区，彻底剥离脑膜及血管。用剪刀剪成约1mm3大小，加入预热的0.05%胰酶，放入37℃消化15min（每7min稍微摇晃一下）。小心吸走消化过组织，用2mL含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，加入100μLDNase I，混匀后使用1mL枪头上下轻柔吹打15下，静置2min，吸取上清液。再像沉淀的组织团块中加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培养基及100μL DNase I，重复上述吹打步骤。吸取上层细胞悬液，如此重复2次。70μm细胞筛过滤，1000r/min离心5min弃上清，使用种植培养基重悬，吸100μL细胞悬液后加入100μL台盼蓝染液，于血球计数器下计数细胞，调整细胞密度至2×105个/mL，每孔加入1mL，十字摇板数次，放入培养箱内。以上操作确保在2h内全部完成。4h后使用无血清DMEM培养基洗板镜检细胞碎片基本去除后，换成Neurobasal培养基，后每2d半量换液。

1.2.4 神经元细胞鉴定 取体外培养7d的海马神经元细胞爬片，吸出培养基，PBS洗1次，加入1mL预热多聚甲醛溶液，确保神经突不被破坏，室温孵育10min。PBS洗1次，0.1%Triton X-100通透膜10min。加入10%山羊血清孵育1h后，加入1%血清稀释的MAP2（1∶500），4℃湿盒孵育过夜。加入1%血清稀释的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶1 000），室温避光孵育1h。DAPI复染5min后，将细胞爬片反转放至滴有抗荧光淬灭封固液的干净载玻片上。避光干燥后使用透明指甲油密封载玻片边缘，激光共聚焦显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 细胞形态的观察 刚接种细胞分散，呈圆形透亮。4h后细胞已贴壁，部分细胞已伸出短小轴突。1～2d后，细胞明显增大，突起延伸，形成稀疏网络。在培养过程中，神经元之间的纤维联系逐渐丰富，并形成网络。5～7d神经元在倒置显微镜下可见具有明显的光晕，此时神经元胞体呈三角形、椭圆形或多边形，边界清楚，胞体明亮，立体感增强（图1、图2）。

3 讨论与结论

神经元是脑及脊髓组织中最基本的组成成分，对神经系统功能的发挥着主要的作用，是脑及脊髓损伤中最常用的细胞，其培养和鉴定技术亦是神经生物学研究中最基本的技术。但是连续的神经元细胞系因无法形成典型的轴突、树突及突触而得不到广泛应用，而原代培养的神经元比传代细胞系更加接近在体状态，是研究工作中较佳的目的细胞，得到了广泛应用。

理论上，原代神经元的培养可通过大脑任何部位及脊髓获取，但海马部位较其他部位神经细胞成分简单，含量多，拥有典型的细胞表型[3-4]。传统方法多采用胎鼠进行海马神经元的培养[5-6]，其神经分化程度低，便于培养，但由于操作复杂，如进行雌雄鼠配种，计算胎龄，实验时间不可控制，取材时胎鼠表面羊水过多，海马较小等导致操作要求高。而采用乳鼠较胎鼠具有较多的优点，可按照实验按需处死一至数只实验乳鼠，取材较胎鼠简单，无需担心缺氧对胎鼠脑神经元的损害。

在海马神经元培养的过程中，很多因素都会影响原代海马神经元培养的质量，如收集细胞过少，接种时死细胞比例过高，杂细胞过多等，其对实验条件的要求较普通细胞更高。首先，除了消化以外，其他操作均在冰上操作，从解剖至接种细胞控制在2h内完成，尽量减少组织细胞代谢。解剖时，在手术显微镜下尽可能去除海马组织表面所有的血管膜，以免消化后被迫吹打，导致接种时死细胞及杂细胞比例过高。其次，组织在消化前用剪刀剪碎，并使用低浓度0.05%胰酶加适量DNA酶，作用时间控制在15min左右，低浓度胰酶消化能力相对温和，死细胞较少，从而避免使用木瓜酶现用现配的缺点。DNA酶可分解消化过程死细胞释放出来的DNA，避免组织缠结，吹打过程可收获更多单细胞悬液。吹打时，采用分步吹打，慢吸慢吹，动作轻柔，保证每一个单细胞都避免过度吹打，尽可能多地收集细胞。再次，使用含10%灭活胎牛血清重悬、接种细胞，其血清成分可促进细胞生长、增殖，4h后换成含B27添加剂的Neurobasal培养基，换液前轻微震荡，可将多数贴壁不牢固的胶质细胞及细胞碎片去除。含B27添加剂的Neurobasal培养基其成分确定，培养出的细胞状态均一，选择性促进神经细胞生长，而胶质细胞几乎不分裂。最后，接种板也是决定实验成败的关键因素，接种板密度过低，神经元突触形成过少，无法利用自身分泌促生长因子，同时胶质细胞分裂过多，难以存活和成熟。密度过高，营养相互争夺，细胞容易抱团生长，均会导致实验失败。本实验胶质细胞含量较少，未使用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长，因阿糖胞苷加入时间及剂量难以控制，毒性较大，除了抑制胶质细胞外，对正常海马神经元亦有毒害作用。

综上所述，采用低浓度胰酶消化，差速贴壁及无血清培养新生SD乳鼠海马神经元的方法简单、稳定、高效，可得到高密度的符合体外实验要求的细胞，为神经系统损伤的研究提供了良好的目的细胞。

参考文献

[1]Kirchberger I，Sinnott A， Charlifue S， et al.Functioning and disability in spinal cord injury from the consumer perspective：an international qualitative study using focus groups and the ICF[J].Spinal Cord.，2010，48（8）：603-613.

[2]Stirling DP， Yong VW.Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry[J].J Neurosci Res.，2008，86（9）：1944-1958.

[3]Calabrese B， Halpain S.Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology[J].Neuron.，2005，48（1）：77-90.

[4]Williams ME， Wilke SA， Daggett A， et al.Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus[J].Neuron.，2011，71（4）：640-655.

[5]Kaech S， Banker G.Culturing hippocampal neurons[J].Nat Protoc.，2006，1（5）：2406-2415.

[6]Fath T， Ke YD， Gunning P，et al.Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons[J].Nat Protoc，2009，4（1）：78-85.

（责编：张宏民）