抗结核药物性肝损害与CYP2E1和GSTM1基因多态性的相关性研究Δ

钟洪兰，李 祥，孟繁荣，李 卫，黄华英（.广州市胸科医院药剂科，广州 50095；.广州市胸科医院肺部疾病研究所，广州 50095）

·精准医疗·

抗结核药物性肝损害与CYP2E1和GSTM1基因多态性的相关性研究Δ

钟洪兰1＊，李 祥1，孟繁荣2，李 卫1，黄华英1（1.广州市胸科医院药剂科，广州 510095；2.广州市胸科医院肺部疾病研究所，广州 510095）

目的：分析抗结核药物性肝损害（ADIH）与细胞色素P450酶（CYP）2E1和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）M1基因多态性的相关性，并探讨其易感因素。方法：选择我院2011年10月－2015年6月收治的我国南方汉族肺结核住院患者91例，根据治疗过程中是否出现ADIH将其分为ADIH组（34例）和无ADIH组（57例）；抽取患者外周静脉血，分别采用聚合酶链式反应（PCR）和多重PCR法检测其CYP2E1和GSTM1基因多态性，采用Logistic回归分析考察ADIH的易感因素。结果：所有患者CYP2E1基因型均为c2/c2型（100%）；GSTM1基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。ADIH组GSTM1（＋/－）基因型患者有9例（26.5%），GSTM1（－/－）基因型患者有25例（73.5%），差异有统计学意义（P＜0.05）；无ADIH组GSTM1（＋/－）基因型患者有17例（29.8%），GSTM1（－/－）基因型患者有40例（70.2%），差异有统计学意义（P＜0.05）；但GSTM1（＋/－）和（－/－）基因型在两组患者中的分布差异均无统计学意义（P＞0.05）。Logistic回归分析结果显示，患者性别、年龄、体质量指数和GSTM1基因型与ADIH均无相关性（P＞0.05）。结论：患者性别、年龄、体质量指数和GSTM1基因型可能与ADIH无关。由于仅检出1种CYP2E1基因型，尚无法判断其多态性与ADIH的相关性。

抗结核药物性肝损害；CYP2E1；GSTM1；基因多态性；相关性

目前，结核病仍然是严重威胁人类健康的疾病，全球有约20亿人感染结核，每年新发结核患者超过900万人，其中约130万死于结核或其并发症[1]。我国的结核防控情况亦不乐观。2010年，我国15岁以上人群中活动性肺结核的患病率为459/10万，涂阳肺结核患病率为66/10万[2]。该症治疗需长时间联用多种抗结核药物，易产生多种药品不良反应（ADR），以药物性肝损害最为常见[3]，其高发生率及严重程度常使抗结核治疗中断，是细菌耐药和抗结核治疗失败的主要原因。抗结核药物性肝损害（Antitubercular drug-induced hepatic-injury，ADIH）与体内代谢酶系统密切相关[4]。由于肝脏中的细胞色素P450酶（CYP）2E1、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）M1和T1、转运蛋白（MRP）2等均参与了ADIH的病理过程[5-6]，且代谢酶的基因分型在不同地域、人群间存在差异，故检测其基因分型或许可以较为准确、全面地预测在抗结核治疗过程中是否会出现ADIH。因此，本研究通过检测我国南方汉族肺结核患者的CYP2E1和GSTM1的基因分型，初步探讨ADIH与其基因多态性的相关性，旨在为结核患者的个体化治疗提供参考。

1 材料

1.1 仪器

C1000TMThermal Cycler聚合酶链式反应（PCR）扩增仪、Gel DocTMXR+ImagineSystem凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；DL-600C型DNA水平电泳仪（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；Centrifuge 5417C型离心机（德国Eppendorf公司）；DRP-9802型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；MilliQ BiacelTMA10TM型纯水仪（美国MilliPORE公司）。

1.2 药品与试剂

通用基因组DNA提取试剂盒[批号：DV811A，包含核糖核酸酶（RNase）A1、溶剂A、溶剂B、溶剂C、溶剂缓冲液、洗液A、洗液B、洗脱缓冲液和核酸纯化柱]、DNA聚合酶（配套10×PCR Buffer、dNTP Mixture和TaKaRa Ex Taq系列，批号：RR001A）、AfaⅠ限制性内切酶[配套AfaⅠ10×缓冲液和0.1%牛血清白蛋白（BSA），批号：1080S]、100 bp DNA条带（DNA Ladder，批号：3422B）均购自宝生物工程（大连）有限公司；SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒[生工生物工程（上海）有限公司，批号：SK8142]；琼脂糖粉（香港基因有限公司，批号：111935）；Gold View核酸染料（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，批号：DH392-5）。

2 方法

2.1 研究对象

选择我院2011年10月－2015年6月确诊为肺结核、祖辈3代及父母双方均为汉族且在我国南方（广东、广西、湖南、湖北、江西、福建）生活的住院患者。结核病诊断依据结核病分类诊断标准[7]，ADIH诊断参照有关药物性肝病的诊断标准[8]及因果关系评价法（RUCAM）。排除罹患肝病、心力衰竭、呼吸衰竭、菌血症等可能引起肝脏损伤疾病者，抗结核治疗前丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）或胆红素升高者及拒绝参与试验的患者。本研究共纳入肺结核患者91例，根据治疗过程中是否出现ADIH分为ADIH组和无ADIH组，分别为34和57例。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

2.2 基因型检测与分析

2.2.1 DNA的提取 抽取患者外周静脉血250 μL，按DNA提取试剂盒说明书操作，提取患者DNA。方法如下：取全血250 μL至收集管中，加入溶剂A 500 μL，加入RNase A1 1 μL，振荡15 s，冰浴5 min；加入溶剂B 4 000 μL，加入4℃溶剂C 1 mL，以离心半径16 cm、转速12 000 r/min离心2 min（下同）；弃去上层有机相，再加入4℃溶剂C 1 mL，充分混匀后，离心；将水相转移至收集管中的过滤杯内，离心；在滤液中加入溶剂缓冲液400 μL，混匀；将其转移至试剂盒中的核酸纯化柱中，离心1 min，弃去滤液；重复冲洗过程1次。将离心后的核酸纯化柱置于另一1.5 mL离心管中，于纯化柱膜中央处加入洗脱缓冲液50～200 μL，室温下静置1 min，离心，洗液置于－20℃冷冻保存，备用。具体方法按说明书进行。

2.2.2 扩增引物 CYP2E1、GSTM1基因扩增所需引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。CYP2E1引物分别为5′-CCA-GTCGAGTCTACATTGTCA-3′（上游引物）、5′-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3′（下游引物）；GSTM1引物分别为5′-CTGCCCTACTTGATTGATGGG-3′（上游引物）、5′-CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3′（下游引物）；内参引物分别为5′-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3′（上游引物）、5′-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3′（下游引物）。

2.2.3 CYP2E1基因扩增及酶切 采用PCR法扩增CYP2E1基因。PCR反应总体积为50 μL，包括5 U/μL TaKaRaEx Taq 0.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、DNA模板1 μL、上游引物及下游引物各2 μL、灭菌蒸馏水35.5 μL。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环35次；最后72℃延伸5 min。PCR产物各取4 μL经1%琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像仪中观察结果。酶切反应体系为AfaⅠ1 μL、10×缓冲液2 μL、0.1%BSA 2 μL、DNA 1 μg，加双蒸水补足至20 μL。酶切条件：37℃下静置1 h，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.2.4 GSTM1基因扩增 采用多重PCR法扩增GSTM1基因与Beta内参。PCR反应总体积为50 μL，包括5 U/μL TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、DNA模板1 μL、上游引物及下游引物各2 μL、灭菌蒸馏水35.5 μL。反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环35次；最后72℃延伸5 min。PCR产物各取4 μL经1%琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像仪中观察结果。

2.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。计量资料以表示，计数资料以频数或百分比表示。采用χ2检验判断CYP2E1、GSTM1基因型分布是否符合Hardy-Weiberg平衡；采用t检验比较不同患者年龄、体质量指数间的差异，采用Logistic回归分析ADIH的易感因素。

3 结果

3.1 患者一般情况

ADIH组患者34例，其中男性29例、女性5例，年龄16～83岁，平均年龄（46.7±18.1）岁，体质量指数（19.1± 2.1）kg/m2；无ADIH组患者57例，其中男性43例、女性14例，年龄15～89岁，平均年龄（49.7±19.9）岁，体质量指数（17.4±2.8）kg/m2。两组患者性别、年龄、体质量指数间的差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

3.2 基因型分型

按“2.2.3”项下条件进行试验得PCR扩增产物酶切片段的长度为360、50 bp。共检出CYP2E1基因型1种，即CYP2E1 c2/c2（突变型纯合子）。CYP2E1基因扩增酶切后电泳结果见图1。

图1 CYP2E1基因扩增酶切后电泳结果Fig 1 Electrophoresis results of CYP2E1 gene amplification and enzyme restriction

按“2.2.4”项下条件进行试验得多重PCR扩增产物凝胶电泳片段的长度为536、273 bp。共检出GSTM1基因型2种，分别为GSTM1（－/－）（缺失型，536 bp）和GSTM1（+/－）（非缺失型，536、273 bp）。GSTM1基因凝胶电泳图见图2。

图2 GSTM1基因凝胶电泳图Fig 2 Gel electrophoresis pattern of GSTM1 gene

3.3 基因型分布

3.3.1 CYP2E1基因型分布 两组患者CYP2E1基因型均为c2/c2型（100%）。

3.3.2 GSTM1基因型分布 ADIH组GSTM1（+/－）基因型患者有9例（占26.5%），（－/－）基因型患者有25例（占73.5%），差异有统计学意义（P＜0.05）；273 bp与536 bp条段基因频率分别为0.13和0.87。无ADIH组GSTM1（+/－）基因型患者有17例（占29.8%），（－/－）基因型患者有40例（占70.2%），差异有统计学意义（P＜0.05）；273 bp与536 bp条段基因频率分别为0.15和 0.85。两组患者GSTM1基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2分别为0.79、1.75，P＞0.05），提示样本来自遗传平衡群体，有较好的代表性；但GSTM1（+/－）和（－/－）基因型在两组患者中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.4 ADIH易感因素分析

Logisitic回归分析结果显示，患者的性别、年龄、体质量指数和GSTM1基因型与ADIH均无相关性（P＞0.05）。各因素与ADIH的相关性见表1。

表1 各因素与ADIH的相关性Tab 1 The association of different factors withADIH

4 讨论

CYP2E1可将异烟肼水解成有肝毒性的乙酰烟肼，导致肝细胞损伤和坏死。研究发现，CYP2E1 c1/c1基因型与肝损害的发生呈正相关[9]。CYP2E1基因型在不同人群中存在不同的分布特点[10]，突变型纯合子（c2/c2基因型）较为少见，但本研究所选的患者基因型均为突变型纯合子。本研究纳入的病例均为随机选择，出现这样的结果可能与其所处地域有关。由于研究病例均为c2/ c2基因型，故在ADIH易感因素分析中，并未考虑CYP2E1基因多态性。

相关性分析结果显示，患者性别、年龄、体质量指数和GSTM1基因型与ADIH无相关性。GST酶是体内重要的Ⅱ相代谢酶，在抗结核药物的解毒和代谢中发挥着重要的作用；GSTM1或GSTT1基因缺失会导致该基因无法编码相应蛋白，对应的酶活性消失，从而使药物毒性代谢产物和还原型谷胱甘肽结合发生障碍，引起肝细胞损害或坏死[11]。相关研究发现，GSTM1基因缺失型是患者发生ADIH的高危因素[12]；但也有研究表明，GSTM1基因型与肝损害的发生无显著性关系[13]。出现这种情况可能与GSTM1和T1酶存在底物交叉现象有关。抗结核药物的毒性产物被GSTM1酶解毒，但也有部分会被GSTT1酶解毒，因此会出现GSTM1基因与ADIH相关性的不同结论。由于本课题组试验条件的限制，本研究未对GSTT1基因多态性进行检测。此外，Ⅱ相代谢酶中的N-乙酰基转移酶-2（NAT2）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）在对毒性物质的转移方面也起着重要的作用，且具有NAT2慢乙酰基因（NAT2*6A/*7B）和GSTM1基因缺失型的患者发生ADIH的概率比只携带1种基因型的患者要高，也进一步提示毒性物质的转移受多种酶的影响[14-15]。因此，不同研究会因人群、种族及其基因型的差异而产生不同的结论。本研究结果显示，虽然ADIH组和无ADIH组GSTM1基因缺失型患者均多于非缺失型患者，但组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），可能与本研究并未综合考虑所选患者NAT2基因分型、样本量较少等因素有关。

综上所述，本研究考察了我国南方汉族人群中CYP2E1和GSTM1基因型与ADIH的关系，但未发现GSTM1基因缺失与ADIH的发生相关；由于本研究所有患者的CYP2E1基因型均一致，故尚无法判断两者的相关性。肝损害的发生过程受多种代谢酶（如GSTT1、NAT2、UGT等酶）的影响，其编码基因也都存在多态性，这些酶之间是否存在关联性值得深入探讨；同时，本研究也提示，足够的样本量和多种基因型的综合分析可能会对揭示ADIH的机制具有更大的帮助。

[1] World Health Organization.Global tuberculosis report：2015 [EB/OL].[2016-06-07].http：//www.who.int/tb/publications/ global_report/en.

[2] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508.

[3] 夏愔愔，詹思延.国内抗结核药品不良反应发生率的综合分析[J].中华结核和呼吸杂志，2007，30（6）：419-423.

[4] Tostmann A，Boeree MJ，Aarnoutse RE，et al.Antituberculosis drug-induced hepatotoxicity：concise up-to-date review[J].J Gastroenterol Hepatol，2008，23（2）：192-202.

[5] 张晓庆，郝晓晖，张利斌，等.CYP2C19基因多态性与抗结核药物性肝损害的关系研究[J].中国药房，2014，25（10）：887-890.

[6] 周利婷，周燕，张国强，等.异烟肼对小鼠肝细胞膜转运体Mrp2，Bsep，P-gp和Ntcp表达的影响[J].中国药学杂志，2014，49（4）：298-302.

[7] 叶任高.内科学[M].6版.北京：人民卫生出版社，2014：39-57.

[8] 权启镇，孙自勤，王要军.新肝脏病学[M].3版.济南：山东科技出版社，2002：895-899.

[9] 王涛，王巍，王仲元，等.细胞色素P4502E1基因多态性与抗结核药物性肝损害的相关性[J].中华结核和呼吸杂志，2009，32（8）：585-587.

[10] 王健，刘焯霖，黎锦如，等.中国广东籍汉族人细胞色素P4502El基因5′侧翼区基因多态性[J].中山医科大学学报，1999，20（1）：29-31.

[11] 冷曙光，宋文佳，王雅文，等.中国汉族人口三种谷胱甘肽S-转移酶基因多态性分析[J].中华预防医学杂志，2001，35（3）：159-162.

[12] 安慧茹，吴雪琼，王仲元.N-乙酰基转移酶2及谷胱甘肽S转移酶M1基因多态性与抗结核药物性肝损伤的关系研究[J].中国防痨杂志，2014，36（1）：14-20.

[13]朱冬林，席云，吴雪琼.GSTM1和GSTT1基因多态性与抗结核药物性肝损害的关系[J].中国抗生素杂志，2011，36（11）：864-868.

[14] 许瑞，刘亚敏，郭振勇.基因多态性与抗结核药物致肝损害易感性研究进展[J].北京医学，2012，34（9）：846-849.

[15] 沈婷婷，张琴，张文宏，等.中国汉族结核病患者N-乙酰基转移酶2基因型与药物性肝损伤以及抗结核疗效的关系[J].中华传染病杂志，2015，3（6）：327-329.

Association ofAntituberculosis Drug-induced Hepatotoxicity with CYP2E1 and GSTM1 Gene Polymorphisms

ZHONG Honglan1，LI Xiang1，MENG Fanrong2，LI Wei1，HUANG Huaying1（1.Dept.of Pharmacy，Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095，China；2.Institute of Lung Disease，Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095，China）

OBJECTIVE：To analyze the association of antituberculosis drug-induced hepatotoxicity（ADIH）with gene polymorphisms of cyptochrome P450（CYP）2E1 and glutathione-S-transferase（GST）M1，and to discuss susceptibility factor.METHODS：91 southern and Han inpatients with tuberculosis were selected from our hospital during Oct.2011-Jun.2015.According to the occurrence of ADIH，those patients were divided into ADIH group（34 cases）and non-ADIH group（57 cases）.Peripheral venous blood of patients were collected，PCR and multiple PCR were used to detect CYP2E1 and GSTM1 gene polymorphisms.The susceptibility factors of ADIH was investigated by Logistic regression analysis.RESULTS：CYP2E1 genotype of all patients were c2/c2 genotype（100%），and GSTM1 genotype distribution met Hardy-Weinberg balance（P＞0.05）.There were 9 patients（26.5%）with GSTM1（+/－）genotype and 25 patients（73.5%）with GSTM1（－/－）genotype in ADIH group，with statistical significance（P＜0.05）.There were 17 patients（29.8%）with GSTM1（+/－）genotype and 40 patients（70.2%）with GSTM1（－/－）genotype in non-ADIH group，with statistical significance（P＜0.05）.There was no statistical significance in the distribution of GSTM1（+/－）and（－/－）genotype between 2 groups（P＞0.05）.Logistic regression analysis showed that there was no correlation of gender，age，BMI and GSTM1 genotype with ADIH（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Gender，age，BMI and GSTM1 genotype may be not correlated with ADIH；The relationship of GSTM1 genotype with ADIH can not be judged because only one kind of CYP2E1 genotype has been detected.

Antituberculosis drug-induced hepatotoxicity；CYP2E1；GSTM1；Gene polymorphisms；Association

R968

A

1001-0408（2017）02-0149-04

广东省医学科研基金项目（No.A2011498）

＊主任药师。研究方向：医院药学。电话：020-83595977。E-mail：zhonghong1206@21cn.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.02.02