镉对背角无齿蚌组织中金属硫蛋白含量的影响

任玉娟，刘蒙南，王兰，刘娜

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

镉对背角无齿蚌组织中金属硫蛋白含量的影响

任玉娟，刘蒙南，王兰，刘娜

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

为研究镉（Cd2+）对背角无齿蚌（Anodonta woodiana）鳃和消化腺中金属硫蛋白（MT）含量的影响，设置1个对照组和3个镉处理组（Cd2+质量浓度分别为0.5，5，50 mg/L），采用镉血红蛋白饱和法分别测定Cd2+处理后第1，4，7，14天和Cd2+清除的第1，4，7，14天鳃和消化腺中MT的含量。结果显示，鳃MT含量在5，50 mg/LCd2+处理的不同阶段均显著或极显著升高（P＜0.05，P＜0.01），而消化腺MT含量只在第7，14天时明显上升（P＜0.05，P＜0.01），0.5 mg/LCd2+仅在第14天时对鳃和消化腺MT含量影响显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）；移入清水后，鳃和消化腺MT含量随着时间延长逐渐回落至对照组水平，但是在后期出现了反弹。由此推断，镉处理可不同程度地诱导背角无齿蚌鳃和消化腺MT含量升高，而清除试验可能对由镉引起的诱导效应有一定的修复作用。

背角无齿蚌；消化腺；鳃；金属硫蛋白；镉

近年来，重金属污染物对自然环境的破坏以及对人类健康的威胁已引起社会的广泛关注，其中尤以镉污染最为突出。镉（Cadmium，Cd）是一种自然界中广泛存在的重金属污染物，主要通过工业生产活动排放到环境中[1]。研究表明，镉对人体的肾、肺、肝、睾丸、脑、骨骼及血液系统均可以产生毒性，引起一系列严重的疾病[2]，还可以导致植物以及动物DNA结构、细胞超微结构改变，组织损伤[3-5]。金属硫蛋白（metallothionein，MT）是一类广泛存在于各种微生物、高等动植物和人类的各种组织、器官中的低分子量金属结合蛋白[6]。MT参与生物体内必需金属元素的调节和非必需金属元素的解毒。但是，MT的解毒和调节作用是有限的，当重金属超过一定阈值时，有机体就会出现病理变化，严重时甚至会危及个体生命[7]。许多海洋贝类，例如青蛤（Cyclina sinensis）、文蛤（Meretrix meretrix）、大珠母贝（Pinctada maxima）、美洲牡蛎（Crassostrea virginica）、贻贝（Mytilus edulis）、海湾扇贝（Argopecten irradians）等MT的研究已有报道[8-13]。但是，关于淡水贝类MT的研究报道较少。

背角无齿蚌（Anodonta woodiana）俗称河蚌，对外界环境的变化非常敏感，易采易养，是理想的水环境污染指示生物。因此，本研究以背角无齿蚌为试验材料，分析镉对其消化腺和鳃组织中MT含量的影响，旨在为镉对贝类致毒作用机制的研究提供理论依据和基础数据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

背角无齿蚌（简称河蚌），购自太原市五龙口水产批发市场，壳长（10.1±1.6）cm，宽（6.6±1.2）cm，高（4.5±1.2）cm。在实验室驯养14 d以上，每48 h换水一次，养殖用水为曝气48 h自来水（pH值7.5，溶氧量8.0～8.3 mg/L）。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 主要仪器高速冷冻离心机（Eppendorf，5804R型），电动匀浆仪（FLUKO，F6/10型），火焰原子吸收光谱仪（美国瓦里安，AA240FS型）。

1.2.2 主要试剂氯化镉（CdCl2·H2O，分析纯），Tris-HCl缓冲液（pH值为8.60，0.01 mol/L），浓硝酸（分析纯），高氯酸（分析纯），牛血红蛋白（Sigma）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计选择个体大小相似的河蚌分为1个对照组和3个处理组，对照组用清水饲养。根据Cd2+对河蚌96 h LC50（134.9 mg/L）[14]及《渔业水质标准（GB 11607—92）》中Cd2+含量标准（＜0.005 mg/L），Cd2+质量浓度设置为0.5，5，50 mg/L，每个处理组设3个平行。经Cd2+染毒14 d的各浓度组河蚌再移入清水中继续饲养，实施Cd2+的清除试验。分别在染毒第1，4，7，14天和清水处理的第1，4，7，14天随机从各处理组中取出3只河蚌，取鳃和消化腺各0.1～0.2 g，经液氮速冻后于-80℃冻存备用。

1.3.2 MT含量的测定利用镉血红蛋白饱和法[15-16]并稍加改进，每克湿组织加入4 mL Tris-HCl缓冲液，电动匀浆器冰浴匀浆后12 000 g，4℃离心15 min。在0.5 mL上清液中加入0.5 mL20 mg/L的CdCl2溶液，混合后室温放置5 min，加入新配制的2%（w/v）牛血红蛋白0.2 mL，混匀，冰浴5 min后沸水浴2 min，冷却后10 000 g，4℃离心10 min，重复2次加牛血红蛋白之后的步骤。上清液消化后，用火焰原子吸收仪检测镉含量，根据MT与镉原子的结合原理，每分子MT结合6个镉原子换算出MT的含量。

1.4 统计分析

试验结果以3个平行组数据的平均值±标准差表示。利用SPSS 15.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 镉暴露和清水处理后背角无齿蚌鳃中MT含量分析

由图1可知，0.5 mg/L Cd2+染毒处理1，4，7 d时并未对河蚌鳃中MT含量产生显著的影响（P＞0.05），只有在染毒14 d时MT含量才被极显著诱导（P＜0.01），但是较高质量浓度的Cd2+（5，50 mg/L）处理则可显著或极显著诱导MT含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；清水处理的第1天，除了0.5 mg/L组，其他处理组MT水平仍显著高于对照组水平（P＜0.05），第4，7天鳃MT含量回落至对照组水平，但在第14天时各处理组MT含量又出现明显上升趋势（P＜0.01）。

2.2 镉暴露和清水处理后背角无齿蚌消化腺中MT含量分析

由图2可知，镉处理1，4 d时，消化腺MT含量未出现显著变化（P＞0.05），当处理时间延长至7 d时，5，50 mg/LCd2+处理组的消化腺MT含量显著升高（P＜0.05），处理14 d时，各Cd2+处理组的MT含量均显著增加（P＜0.05），且在5 mg/L Cd2+处理组达到最大值；当河蚌被移入清水后，各Cd2+处理组的消化腺MT含量基本都回落至对照组水平，只有7，14 d的0.5 mg/L处理组和14 d的50 mg/L处理组的MT含量仍高于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

近年来，关于重金属对水生生物MT毒性影响的相关研究日益增多[17-19]。MT所富含的半胱氨酸的巯基可以与重金属配位结合并将其排出体外，从而对机体中的重金属起到一定的解毒作用。SERAFIM等[20]研究发现，在锌、镉、铜联合染毒下，随着处理时间的延长，沟纹蛤仔（Ruditapes decussatus）的鳃、消化腺和其他组织的MT含量基本呈上升趋势，说明重金属可能对MT有一定的诱导作用。本研究结果显示，随着镉浓度的增大和处理时间的延长，河蚌鳃中MT含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），这与镉对南极帽贝（Laternula elliptica）[21]和贻贝（Mytilus galloprovincialis）[22]的鳃MT含量的影响类似。在相同的处理时间内，河蚌鳃中MT含量随着镉浓度的增大基本呈先升后降的趋势，这可能是由于高浓度镉处理下动物组织内蓄积的重金属量大大超过MT的结合能力所致。由此推测，过量的镉将可能对机体引起明显的毒性效应，如鳃结构的改变，酶活性中心被破坏，导致酶失活及DNA的损伤等[23-25]。本试验中，短时间（1，4 d）的镉处理未对消化腺MT含量产生显著影响，直至镉处理时间延长至7 d时，较高镉浓度组（5，50 mg/L）的消化腺MT含量出现显著升高（P＜0.05）。由此推测，低浓度、短时间的镉暴露，消化腺中MT含量维持在正常水平，可能在解毒和稳态维持方面并没有发挥明显的作用，而对镉的解毒作用可能更多的是通过机体中其他的金属结合蛋白等实现的。处理时间延长、镉浓度增大时，消化腺MT含量显著升高，说明当机体中镉含量增加到一定程度时，MT才可能被大量地诱导表达而发挥解毒作用，以缓解镉胁迫对机体造成的损伤。

研究发现，镉对MT含量的影响存在组织特异性。本试验结果显示，河蚌鳃和消化腺中的MT水平存在组织差异性，且镉对2种组织中MT含量的诱导程度也不同。关于菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）[26]的研究发现，在一定浓度镉胁迫下，消化腺和鳃组织中MT含量均显著高于对照组水平，且消化腺的MT含量明显高于鳃。本试验中，镉胁迫下消化腺MT水平明显高于鳃中。这可能是由于消化腺是重金属蓄积的主要组织，是MT合成的重要场所。COSSON等[27]发现，在试验条件下贻贝鳃组织中MT比消化腺中MT对重金属离子的诱导更加敏感，这与本试验结果相似。河蚌主要通过鳃的滤水作用来进行呼吸、摄食、排泄甚至辅助生殖，而鳃又是最先接触污染物的组织，因此，其受污染物的影响较严重，污染物对鳃MT的诱导程度也较大，相对来说消化腺是内脏团组织，没有鳃那么容易受外界离子的影响[28]。

本试验中，在清水处理前期，鳃和消化腺MT含量逐渐下降并回落至对照组水平，但在清水处理的后期（7，14 d）又明显上升。这可能是因为镉对河蚌的毒性较大而产生了较强、较持久的影响，恢复期间MT含量的波动表明机体对镉引起的损伤修复可能需要更长的时间，在后续研究中建议延长清水处理时间直至MT含量恢复至正常水平稳定为止，以便更全面地分析其修复机制。

综上所述，不同浓度和时间的镉处理后，背角无齿蚌鳃和消化腺中MT的含量有不同程度的升高，且消化腺中MT水平明显高于鳃，镉对2种组织MT含量的诱导程度不同。清水处理对于镉引起的背角无齿蚌鳃和消化腺MT含量升高有一定的修复作用，体现为MT含量的逐渐回落，但在清水处理后期MT含量再次升高。

［1］CHEN Q L，GONG Y，LUO Z，et al.Differential effect of waterborne cadmium exposure on lipid metabolism in liver and muscle of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco[J].Aquatic Toxicology，2013，142：380-386.

［2］杨杏芬，吴永宁.镉对人群健康效应研究需要注重肾损害水平之下的低剂量暴露[J].中华预防医学杂志，2016，50（4）：292-295.

［3］宇克莉，孟庆敏，邹金华.镉对玉米幼苗生长、叶绿素含量及细胞超微结构的影响[J].华北农学报，2010，25（3）：118-123.

［4］张海棠，刘玺，刘耀东，等.动物性食品镉离子污染及其毒性作用[J].山西农业科学，2008，36（12）：123-126.

［5］李涌泉，杨惠珍，任玉娟，等.镉对背角无齿蚌外套膜细胞凋亡相关酶活性和细胞结构的影响[J].山西农业科学，2016，44（8）：1108-1113.

［6］王文君，吕娜，尹锐，等.金属硫蛋白研究进展[J].江苏农业科学，2016，44（1）：13-16.

［7］THORNALLEY P J，VASÁK M.Possible role for metallothionein in protection against radiation-induced oxidative stress.Kinetics and mechanism of its reaction with superoxide and hydroxyl radicals[J]. Biochimica Et Biophysica Acta，1985，827（1）：36-44.

［8］吕达，罗凯娅，潘宝平，等.青蛤（Cyclina sinensis）金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因的克隆与表达分析[J].海洋与湖沼，2012，43（1）：47-51.

［9］高祥刚，赫崇波，李云峰，等.文蛤金属硫蛋白基因的克隆与分析[J].水产学杂志，2009，22（4）：8-11.

［10］唐仁生，夏建红，王玉梅，等.大珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析[J].安徽农业科学，2009，37（7）：2888-2890.

［11］RIDLINGTON J W，FOWLER B A.Isolation and partial characterization of a cadmium-binding protein from the American oyster（Crassostreavirginica）[J].Chemico-BiologicalInteractions，1979，25（2/3）：127-138.

［12］BEBIANNOM J，LANGSTON W J.Cadmium induction of metallothionein synthesis in Mytilus galloprovincialis[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Comparative Pharmacology，1992，103（1）：79-85.

［13］刘维青，倪多娇，宋林生，等.海湾扇贝（Argopecten irradians）金属硫蛋白基因的克隆与分析[J].海洋与湖沼，2006，37（5）：444-449.

［14］杨惠珍，刘娜，李涌泉，等.镉对背角无齿蚌主要组织谷胱甘肽含量和相关酶活性的影响[J].农业环境科学学报，2015，34（1）：15-21.

［15］ONASAKA S，CHERIAN MG.Comparison of metallothionein determination by polarographic and cadmium-saturation methods[J]. Toxicologyand Applied Pharmacology，1982，63：270.

［16］MARTÍN-DÍAZ L M，VILLENA-LINCOLN A，BAMBER S，et al. An integrated approach using bioaccumulation and biomarker measurement in female shore crab，Carcinus maenas[J].Chemosphere，2005，58（5）：615-656.

［17］ROCHA T L，GOMES T，DURIGON E G，et al.Subcellular partitioning kinetics,metallothionein response and oxidative damage in the marine mussel Mytilus galloprovincialis exposed to cadmium-based quantum dots[J].Science of the Total Environment， 2016，554-555：130-141.

［18］LI S，SHENG L X，XU J B，et al.The induction of metallothioneins during pulsed cadmium exposure to Daphnia magna：Recovery and trans-generational effect[J].Ecotoxicologyand Environmental Safety，2016，126：71-77.

［19］KIM J H，KANG J C.Oxidative stress，neurotoxicity，and metallothionein（MT）gene expression in juvenile rock fish Sebastes schlegelii under the different levels of dietary chromium（Cr6+）exposure[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2016，125：78-84.

［20］SERAFIMA，BEBIANNO MJ.Effect of a polymetallic mixture on metal accumulation and metallothionein response in the clam Ruditapes decussatus[J].Aquatic Toxicology，2010，99（3）：370-378.

［21］CHOI H J，JI J，CHUNG K，et al.Cadmium bioaccumulation and detoxification in the gill and digestive gland ofthe Antarctic bivalve Laternula elliptica[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology&Pharmacology，2007，145（2）：227-235.

［22］BEBIANNO M J，SERAFIM M A.Comparison of metallothionein induction in response to cadmium in the gills of the bivalve molluscs Mytilus galloprovincialis and Ruditapes decussatus[J].Science ofthe Total Environment，1998，214（1/3）：123-131.

［23］BOSAS C，MARTINEZ E，GAXIOLA G，et al.The effect of dissolved oxygen and salinity on oxygen consumption，ammonia excretion and osmotic pressure of Penaeas setiferus juveniles[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，1999，234（1）：41-57.

［24］HOGSTRAND C，HAUX C.Binding and detoxification of heavy metals in lower vertebrates with reference to metallothionein[J]. Comparative Biochemistry and Physiology（Part C），1991，100（1/2）：137-141.

［25］刘蒙南，刘娜，李涌泉，等.镉对背角无齿蚌消化腺和鳃组织SOD活力的影响[J].山西农业科学，2016，44（6）：750-753.

［26］WANG L，PAN L Q，LIU N，et al.Biomarkers and bioaccumulation of clam Ruditapes philippinarum in response to combined cadmium and benzo[α]pyrene exposure[J].Food and Chemical Toxicology，2011，49：3407-3417.

［27］COSSONR P.Bivalve metallothionein as a biomarker of aquatic ecosystem pollution by trace metals：limits and perspectives[J].Cellular and Molecular Biology（Noisy-le-Grand，France），2000，46（2）：295-309.

［28］邓云翠.马氏珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆及其在不同环境因子影响下的表达[D].湛江：广东海洋大学，2013.

Effect of Cadmium on the Content of Metallothionein in the Tissues of the Freshwater Mussel，Anodonta woodiana

RENYujuan，LIUMengnan，WANGLan，LIUNa
（College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The aim ofthis study was to investigate the effect of cadmium（Cd2+）on the content of metallothionein（MT）in the gills and digestive glands of the freshwater mussel（Anodonta woodiana）.The freshwater mussels were exposed to different concentrations of Cd2+（0,0.5,5,50 mg/L）for 14 days then moved intoclean water and cultured for another 14 days.The content ofMTin the tissues ofthe freshwater mussels was measured by Cd-Hb Saturation in different treatment period.The results showed that the content of MT in the gills was induced significantly（P＜0.05,P＜0.01）by 5 and 50 mg/L Cd2+during the exposure period,while the content of MT in the digestive glands was increased notably（P＜0.05,P＜0.01）onlyat 7 d and 14 d.The content ofMTin the gills and digestive glands was induced prominently（P＜0.05,P＜0.01）by 0.5 mg/L Cd2+merely at 14 d.After Cd2+exposure for 14 days,the freshwater mussels were moved into clean water and the content ofMT was decreased gradually with the extension ofclean water treatment,but enhanced again at 14 d（P＜0.05,P＜0.01）.It is concluded that the content ofMTin the gills and digestive glands ofthe freshwater mussels can be induced remarkably by higher concentrations of Cd2+exposure（5,50 mg/L）and the toxicity effect of Cd2+might be repaired by clean water exposure.But further researches are still needed toconfirmthe repairingeffect ofclean water.

Anodonta woodiana;digestive gland;gill;metallothionein;cadmium

X174

：A

：1002-2481（2017）02-0211-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.17

2016-09-12

山西省基础研究计划项目（2013021022-4）；山西省留学回国人员科技活动择优资助项目（2014）；山西省回国留学人员科研资助项目（2014-016）

任玉娟（1992-），女，山西孝义人，在读硕士，研究方向：水生动物毒理。刘娜为通信作者。