沙棘叶科罗索酸浓缩物的毒理学研究

王斌，张琼姝，杨雪芳，张洋洋，郭海利，张小民

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西金科海生物技术有限公司，山西太原030006）

沙棘叶科罗索酸浓缩物的毒理学研究

王斌1，张琼姝1，杨雪芳1，张洋洋1，郭海利2，张小民1

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西金科海生物技术有限公司，山西太原030006）

按照食品安全性毒理学评价程序和方法对沙棘叶科罗索酸浓缩物进行了小鼠急性经口毒性试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验。小鼠急性经口毒性试验结果表明，沙棘叶浓缩物对雌雄小鼠经口最大耐受剂量（MTD）均大于15 g/kg，为无毒级物质；小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验结果表明，该检品未呈现有致突变性。通过食品安全性毒理学评价，不仅可为沙棘叶浓缩物可食性提供理论依据，也会对整个沙棘叶的开发起到积极的推动作用。

中国沙棘；叶；提取物；毒理学

科罗索酸具有较高的药用价值，比如降血糖[1]、抗氧化[2]、调血脂[3]、抗抑郁[4]以及抗心律失常[5]等。沙棘叶中含有科罗索酸，已有许多有关其的研究。吴哲等[6]采用HPLC法测定了沙棘叶中科罗索酸的含量；田晓东等[7]对沙棘叶科罗索酸的浓缩工艺进行了研究；张璐等[8]确定了沙棘叶浓缩物中科罗索酸的测定方法。沙棘在山西有着得天独厚的资源优势，山西现有沙棘林面积为56万hm2[9]。近年来，研究者还发现，沙棘叶中含有多种营养物质和生物活性物质，金婷等[10]证明，沙棘叶中蛋白质、氨基酸、维生素C、脂溶性维生素A、K、E等含量丰富，同时还含有多种不饱和脂肪酸、葡萄糖、果糖、半乳糖以及其他生物活性物质；赵丽萍等[11]研究发现，沙棘叶中含有豆甾醇、齐墩果酸、槲皮素、表儿茶素、对羟基苯甲酸丁酯等化合物；付阳等[12]通过高效液相-电喷雾质谱法测定了沙棘叶中槲皮素、杨梅素、芦丁、异鼠李素、山奈酚的含量。

沙棘叶不仅含有较多的生物活性成分，而且这些成分中的黄酮类物质在治疗心血管疾病方面有着突出作用。李淑珍等[13]建立了总黄酮含量的测定方法，并对沙棘叶总黄酮提取工艺进行了优化[14]；安乐等[15]建立了沙棘叶总黄酮的最佳提取纯化工艺。此外，沙棘中齐墩果酸是肝病的辅助治疗药物，对急慢性肝损伤有明显的保护作用；芦丁主要用于脆性增加的毛细血管出血症，也用于高血压、脑出血、视网膜出血、出血性紫癜、急性出血性肾炎、再发性鼻出血、创伤性肺出血、产后出血等的辅助治疗；科罗索酸通过加快葡萄糖的转运，促进细胞对葡萄糖的吸收和利用，从而实现其降血糖功效。由于科罗索酸对葡萄糖转运的兴奋作用类似于胰岛素，因此，科罗索酸也被称为植物胰岛素。近年来的研究表明，沙棘叶有着较高的开发和利用价值。

本研究为推进沙棘叶科罗索酸浓缩物的利用和开发，按食品安全性毒理学评价程序和方法进行了小鼠急性经口毒性试验、小鼠骨髓细胞微核试验以及小鼠精子畸形试验，这不仅可为沙棘叶浓缩物的食用安全提供依据，也将会加快整个沙棘叶的开发进程。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 沙棘叶沙棘叶采自山西祁县来远镇唐河底，为野生中国沙棘（Hippophae rhamnoides L.Subsp.Sinensis Rousi）。

1.1.2 试验动物清洁级昆明种小鼠，购自北京维通利华试验动物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 沙棘叶浓缩物的获取将沙棘叶经60℃干燥箱干燥，粉碎，过0.25 mm筛，置于蒸馏水中，加热至80℃，浸泡4 h，过滤并弃滤液，将沙棘叶于60℃烘干。烘干后的沙棘叶置于圆底烧瓶中，按料液比1∶10加入无水乙醇，90℃回流3 h，过滤后将滤液倒入旋转蒸发瓶，减压回收乙醇，制得浸膏，4℃保存。

1.2.2 小鼠毒理试验

1.2.2.1 小鼠急性经口毒性试验按GB15193.3—2003急性毒性试验方法中最大耐受剂量法进行。选体质量为19～22 g的健康小鼠20只，雌雄各占1/2。小鼠禁食14 h，称取受试物15 g，加蒸馏水至40 mL。2次经口灌胃给予受试物，每千克体质量灌胃量为20 mL，中间间隔6 h，合并剂量为15 g/kg。14 d后记录中毒症状及死亡情况。

1.2.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验按GB15193.5— 2003骨髓细胞微核试验进行。选用体质量为25～30 g的健康小鼠50只，按照体质量随机分为5组，每组10只，雌雄各占1/2，处理剂量分别为2.5，5，10 g/kg，同时设置溶剂对照组（蒸馏水）和阳性对照组（环磷酰胺50 mg/kg）。各剂量溶液配制方法：称取受试物2.5，5，10 g，分别加蒸馏水至20 mL，依次为低、中、高剂量组；取环磷酰胺储备液（25 mg/mL）2 mL加蒸馏水至20 mL为阳性对照组，溶剂对照组为蒸馏水。各组均按20 mL/kg经口灌胃，受试物现用现配。各组均采用2次经口给受试物，中间间隔24 h，于第2次给受试物后6 h处死动物，取一侧股骨制备骨髓涂片，Gimsa染色后镜检计数嗜多染红细胞中的微核发生率。

1.2.2.3 小鼠精子畸形试验按GB15193.7—2003小鼠精子畸形试验进行。选体质量为26～35 g的雄性性成熟小鼠25只，按照体质量随机分为5组，每组5只，设3个剂量组，即2.5，5，10 g/kg，同时设溶剂对照组（蒸馏水）和阳性对照组（环磷酰胺50 mg/kg）。各剂量溶液配制方法同1.2.2.2。各组均按20 mL/kg的体积经口灌胃，受试物现用现配。连续5 d经口给予受试物，一天一次，均于首次给受试物后的第35天处死动物，取两侧副睾，制备精子标本，高倍镜下检查每只动物的精子形态，计数结构完整精子1 000个。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

在14 d的观察期内，动物未见明显中毒症状；眼、鼻、口未见分泌物，无肿胀现象；粪便黑灰色，呈麦粒状，外阴部光洁；被毛整洁光滑、乳白色，黏膜无充血、水肿，体质量增长正常，无一动物死亡。表明该受试物对雌雄小鼠经口最大耐受剂量（MTD）均大于15 g/kg（表1）。

表1 沙棘叶提取物对小鼠急性经口毒性试验结果

2.2 小鼠骨髓细胞微核试验

经单因素方差分析可知，各剂量组微核细胞率与溶剂对照组相比，差异均无显著性（P＞0.05），且微核细胞率均在文献报道的正常组的正常值范围之内，而阳性对照组微核细胞率与溶剂对照组以及各剂量组之间进行比较，差异达极显著（P＜0.01）（表2）。

2.3 小鼠精子畸形试验

经单因素方差分析可知，各剂量精子畸形率与溶剂对照组相比，差异不显著（P＞0.05），而阳性对照组精子畸形率与溶剂对照组及各剂量组相比，差异极显著（P＜0.01）（表3）。

表2 沙棘叶提取物对小鼠骨髓细胞微核率的影响

表3 沙棘叶提取物对小鼠精子畸形率的影响

3 讨论与讨论

根据《食品安全性毒理学评价程序和方法》（GB 15193.1～15193.21—2003）的要求，对沙棘叶科罗索酸浓缩物进行了小鼠急性经口毒性试验及2项致突变试验。小鼠急性经口毒性试验结果表明，在14 d的观察期内，动物未见明显中毒症状，被毛整洁光滑，黏膜无充血、水肿，体质量增长正常，无一动物死亡。表明该受试物对雌雄小鼠经口MTD均大于15 g/kg。按急性毒性剂量分级标准属无毒级物质。

小鼠骨髓细胞微核试验结果表明，各剂量组微核细胞率与溶剂对照组相比，差异均无显著性（P＞0.05），而阳性对照组微核细胞率与溶剂对照组以及各剂量组相比，差异极显著（P＜0.01），说明沙棘叶浓缩物未使小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率发生改变。

小鼠精子畸形试验结果表明，各剂量精子畸形率与溶剂对照组相比，差异均不显著（P＞0.05），而阳性对照组精子畸形率与溶剂对照组及各剂量组相比，差异极显著（P＜0.01），说明沙棘叶浓缩物在所涉及剂量范围内不会引起小鼠畸形率增高。

沙棘虽然是果叶两用植物，但对沙棘叶的开发远不如沙棘果，张小民等[16]按照食品安全性毒理学评价程序和方法对沙棘叶进行了急性毒性试验和骨髓细胞微核试验，初步证明了沙棘叶作为新的食物资源的安全性。刘绪川等[17]研究指出，用沙棘叶长期饲喂试验动物无蓄积性毒害，不影响动物繁殖，对胚胎也无致畸作用，更无致癌或促发肿瘤作用，长期饲喂还能提高机体抗病力。刘艳丰等[18]研究了沙棘叶黄酮对绵羊瘤胃代谢和血清指标的影响，结果认为，在绵羊日粮中添加沙棘叶黄酮，可以提高绵羊蛋白质的合成，调节脂类代谢，增加细胞因子的含量，有益于免疫力的提高，建议在绵羊日粮中添加0.25%的沙棘叶黄酮。山西省沙棘资源丰富，面积大，分布广，每年都有大量的枝叶产生，对沙棘叶的深入研究，将会加快沙棘叶的开发利用进程，为沙棘叶在医药领域的拓展起到推动作用。

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Toxicologic Study on Corosolic Acid Concentrations of Seabuckthorn Leaves

WANGBin1，ZHANGQiongshu1，YANGXuefang1，ZHANGYangyang1，GUOHaili2，ZHANGXiaomin1
（1.College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；
2.Shanxi Jinkehai Biological TechnologyCo.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

The acute oral toxicity,micronucleus test of bone marrow and sperm shape abnormality test in mice was applid on corosolic acid concentrations of seabuckthorn leaves according to the evaluation processes and methods of food safety toxicology.The acute oral toxicity showed the maximum tolerated dosesea（MTD）of seabuckthorn leaves concentrations through the mouth of mice was greater than 15 g/kg,indicating the seabuckthorn leaves concentrations had no toxic.The micronucleus test and sperm shape abnormality test demonstrated that the examined sample didn't presented mutagennicity.On the basis ofthe evaluation processes and methods of food safety toxicology,this study not only provided theoretical basis for edibility of seabuckthorn leaves concentrations,but promoted the seabuckthorn leaves exploitation actively.

Chinese seabuckthorn;leaves;extractive;toxicology

S793.6

：A文献标识码：1002-2481（2017）02-0203-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.14

2016-11-17

王斌（1988-），男，山西晋中人，在读硕士，研究方向：动物学。张小民为通信作者。