利用果胶降解菌塔宾曲霉GYC 501改善梗丝品质及其发酵条件的优化

龙章德，陈皓睿，刘 鸿*，邹克兴，孙建生，李季刚，薛 云，申佩弘*

(1.广西中烟工业有限责任公司，广西 南宁 530001；2.广西大学 生命科学与技术学院，广西 南宁530005)

利用果胶降解菌塔宾曲霉GYC 501改善梗丝品质及其发酵条件的优化

龙章德1，陈皓睿2，刘 鸿1*，邹克兴1，孙建生1，李季刚1，薛 云1，申佩弘2*

(1.广西中烟工业有限责任公司，广西 南宁 530001；2.广西大学 生命科学与技术学院，广西 南宁530005)

烟草梗丝中含有大量果胶、纤维素等细胞壁物质，造成吸味不好，对其在烟制品中的应用造成了阻碍。本研究旨在利用GYC 501的发酵酶液处理烟草梗丝，以降解其中以果胶为主的多糖，改善吸味。本研究首先建立了一种测定烟草梗丝中果胶含量相对简易的方法，并从发酵时间、缓冲液浓度、缓冲液pH值、发酵温度、酶的使用量入手，先进行单因素优化实验再进行正交实验,以优化发酵条件。结果显示：使用塔宾曲霉(Aspergillustubingensis) GYC 501在烟草梗丝培养基中发酵48 h后所得到的发酵液对烟草梗丝进行发酵处理，得到最优发酵条件：酶使用量为1536 U，发酵时间为12 h，温度为42 ℃，缓冲液pH为4.8，缓冲液浓度为0.3 mol/L，梗丝含水量为50%。在此最优发酵条件下,梗丝果胶降解率最佳，为34.97%。

烟草梗丝；塔宾曲霉；果胶酶；条件优化；正交试验

烟草梗丝在加入酶后其品质有一定程度的提升，不光是吸味的改善[1]，还能提升烟梗在成烟中的填充率[2]。酶的优点是有效降低化学反应势能差，同时效率较化学法高很多，而且污染少、利用率高。利用酶解技术提高烟梗质量的报道并不多，肖瑞云等利用多种多糖水解酶研究了不同组合的复合酶对烟梗吸味的影响，发现主要的影响是烟气协调性指标的改善较为明显[3]。张见等的研究更深入，经研究发现各因素对烟梗还原糖含量影响显著性排序是：水分>纤维素酶Ⅰ>果胶酶Ⅱ>温度>果胶酶Ⅰ，优化条件后半乳糖醛酸含量约为原来的10倍，果胶降解显著[4-5]。徐达等的研究同样具有相似的效果，梗丝水解后水溶性总糖含量提高了23.31%，果胶含量降低了17.26%[6]。也有报道将生香酵母接种于灭菌后的烟梗提取液上，在30 ℃下发酵2 d,结果表明发酵后的烟梗提取液中的可溶性糖，特别是葡萄糖含量明显降低，同时有机酸含量增加,酸值提高，葡萄糖含量的降低对烟产品来说是不利的，虽然香气有所提高但并不能说改善了烟梗质量[7]。

利用酶解与发酵技术是现今提高烟草梗丝质量的热点，本研究拟利用从茶叶中获得的塔宾曲霉(Aspergillustubingensis) GYC 501，通过发酵条件优化，降低梗丝中果胶含量，改善梗丝品质。同时研究建立一套草酸铵浸提法测定烟梗果胶含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烟草梗丝：来源于烟厂生产原料，空白膨胀梗丝(初始含水量12%)。

GYC 501发酵培养基：1.5 g烟草梗丝，加入50 mL蒸馏水，115 ℃湿热灭菌30 min，取出冷却后即可用于发酵。

含盐酸的无水乙醇：将11 mL浓盐酸与1 L无水乙醇混合。

1.2 实验方法

1.2.1 检测烟草中果胶的方法 本方法中的果胶含量测定部分来自国标法(GB/T 10742─2008)。

在无菌环境下将GYC 501孢子接入GYC 501发酵培养基中，37 ℃摇床培养48 h，取出后先用一层纱布过滤，再用滤纸(快速型)过滤，得到GYC 501发酵酶液。之前的研究表明：GYC 501发酵液每1 mL酶液的酶活为192 U(将50 ℃反应30 min，每毫升酶液每小时水解苹果果胶生成1 mg半乳糖醛酸的能力定义为一个酶活力单位)。将上一步得到的酶液加入到柠檬酸-柠檬酸钠溶液中(体积比例7∶3)，混合均匀后，均匀喷施于15 g烟梗上，加入后梗丝含水量为一定数值，恒温培养箱中放置，分不同时间取出。 将处理过的(或未处理的空白对照)烟梗加入到800 mL 1%草酸铵溶液中，100 ℃水浴锅中抽提3 h，隔0.5 h混匀一次。取出，使用16层纱布过滤液体部分，将残渣留于瓶底，得抽提液。再次用200 mL 1%草酸铵溶液在相同条件下抽提0.5 h，将两次抽提液混合，定容至1 L，混合均匀。 取50 mL上一步所得液体，立即加入180 mL含盐酸的无水乙醇，混匀后过夜沉淀，滤纸过滤，烘干后称重，计算粗果胶含量。

1.2.2 GYC 501发酵液降解梗丝的条件优化 本实验初始梗丝处理条件为：酶加入量1536 U(7.98 mL GYC 501发酵酶液)，加入发酵液后，用pH 5.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将梗丝含水量调节为50%，缓冲液终浓度为0.1 mol/L，恒温培养的温度为37 ℃，处理时间分别为1、2、4、6、12、24、36、48、72 h，以确定处理时间。

此阶段使用上一部分实验建立的方法模型对GYC 501发酵液以及烟草梗丝的缓冲液pH、缓冲液浓度、处理梗丝的含水量、发酵温度以及酶用量这5个条件，进行优化处理。

1.2.2.1 缓冲液pH 分别配制柠檬酸、柠檬酸钠缓冲液，按比例混合，pH 3.6按14.9∶5.1，pH 4.2按12.3∶7.7，pH 4.8按9.2∶10.8，pH 5.4按6.4∶13.6，pH 6.0按3.8∶16.2比例混合。发酵方法同1.2.1。

1.2.2.2 缓冲液浓度 按6.4∶13.6混合柠檬酸、柠檬酸钠，终浓度设置为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，缓冲液浓度为0时使用蒸馏水代替。发酵方法同1.2.1。

1.2.2.3 梗丝含水量 将GYC 501发酵液浓缩1倍，将缓冲液配制成pH 5.4，并与一定量的酶液混合，终浓度为0.1 mol/L，使最终加入的酶量为1536 U，最终含水量分别调至30%、35%、40%、45%、50%。其它条件与1.2.1中的相同。

1.2.2.4 温度 使用1.2.2.3的条件将1.2.1中的发酵温度调整为32、37、42、47 ℃。

1.2.2.5 酶用量 使用1.2.2.3的条件将酶用量调整为768、1536 、2189 、4378 U。

1.2.3 梗丝降解条件的正交优化 在果胶降解工艺的单因素优化之后，为确定多因素对梗丝果胶降解率的显著影响，挑选温度、缓冲液pH值、缓冲液浓度、处理时梗丝含水量这4个因素进行三水平正交试验，条件设置如表1。

表1 正交试验设计

温度选择在32、37、42 ℃是因为较低的温度不利于酶发挥作用，而高于42 ℃会降低烟草梗丝的质量；缓冲液pH条件根据上述单因素试验制定；缓冲液浓度条件也是根据上述试验制定；处理时梗丝含水量不超过50%，是根据烟草梗丝处理过程含水量的限制决定的。酶用量为1536 U，处理时间为12 h。

1.2.4 正交最优解的验证 从1.2.3正交试验结果中得出可能的最优组合：温度为42 ℃，缓冲液pH为4.8，缓冲液浓度为0.3 mol/L，处理时梗丝含水量为50%。遂使用此条件验证正交最优解。酶用量为1536 U，处理时间为12 h。

2 结果与分析

2.1 梗丝降解实验

塔宾曲霉GYC 501的发酵液处理梗丝的效果良好(图1)，1 h的降解效率就已经达到18.65%，12 h能达到27.2%，而随着时间的增加，36 h之后降解效率不再增加，说明发酵液中的酶活性在12 h后开始迅速降低。酶活性降低的主要因素有：其一，果胶被分解产生半乳糖醛酸，其为酸性物质，当其生成量达到一定值时，缓冲液已经无法承受巨大的pH变化，溶剂系统pH不再适合酶发挥作用，或者变性；其二，随着时间变化，高温环境下的酶缓慢失活。遂下述实验采用12 h作为发酵终点。

2.2 梗丝降解的条件优化

2.2.1 缓冲液pH pH为6的缓冲液处理效果最好(图2)，但总体来说缓冲液pH对降解效率影响相对较小。根据之前的研究[8]，GYC 501的生长pH为偏酸性，所以下述实验缓冲液pH维持在5.4。

图2 GYC 501发酵液在不同pH下对梗丝的降解效果

2.2.2 缓冲液浓度 如图3所示，缓冲液浓度为0 mol/L即无缓冲液时的降解效率为18.39%，效果最差；0.2 mol/L效果最好，为34.46%。由于过高的缓冲液浓度对烟草吸味影响极大，而缺少缓冲液则会影响酶正常发挥作用，遂以下实验的缓冲液浓度维持0.1 mol/L不变。

2.2.3 梗丝含水量 含水量的数据(图4)显示，含水量对梗丝降解率影响巨大，含水量越大，果胶降解效率越好，但含水量过大不利于储存等后续处理，所以选择50%的含水量用于实验。

2.2.4 温度 在图5中的温度范围内，温度对酶解的影响并不大，但是过高的温度造成酶的失活，降低降解效率；以37 ℃为最佳。下述实验采用37 ℃为发酵温度。

图3 GYC 501发酵液在不同缓冲液浓度下对梗丝的降解效果

图4 GYC 501发酵液在不同梗丝含水量下对梗丝的降解效果

图5 GYC 501发酵液在不同温度下对梗丝的降解效果

2.2.5 酶用量 本实验表明(图6)，并非酶用量越大发酵效果越好，在设定条件下，酶加入量2189 U处理效果(果胶降解率32.38%)与4378 U的处理效果(果胶降解率32.64%)几乎没有差别。

图6 GYC 501不同酶用量对梗丝的降解效果

2.3 梗丝降解条件的正交优化

正交试验显示：基于设计的4种因素的取值范围，它们对烟草梗丝降解效率影响的大小顺序为：处理时梗丝含水量>缓冲液pH>温度>缓冲液浓度。从实验结果中得出可能的最优组合：温度为42 ℃，缓冲液pH为4.8，缓冲液浓度为0.3 mol/L，处理时梗丝含水量为50%。

正交试验中，在组合实验号为3(表2)的条件下达到的最佳梗丝果胶降解效果(果胶降解率为33.52%)与2.2.5优化后的降解效果(果胶降解率为32.38%)相近，但是该条件下使用的酶用量仅为1536 U(2.2.5优化后采用的酶用量为2189 U)，可见经过合理的正交优化设计，在提高梗丝果胶物降解效果的情况下，避免了过高的酶用量，而酶加入量的提高将直接使梗丝抽吸效果大打折扣。但是实际处理条件要根据烟梗抽吸结果做出一定妥协。

表2 正交试验结果L9(34)

2.4 正交最优解的验证

正交最优解的验证实验得到的梗丝果胶物降解率为34.97%，所以根据正交试验推测的最优组合为：温度42 ℃，缓冲液pH 4.8，缓冲液浓度0.3 mol/L，处理时梗丝含水量50%。

3 讨论

梗丝由于多糖类物质含量高，引起吸味不佳，能应用到烟草加工中的量非常有限，造成了浪费。本研究利用本实验室前期从烟梗中筛选到的能高效降解果胶的真菌GYC501对梗丝进行针对性的发酵，目的就是减少多糖含量，增加香气的前体物质还原性糖含量。利用微生物发酵酶液来低成本降解烟梗多糖物质的相关研究较少。郝辉等成功利用微紫青霉(Penicilliumjanthinellumsw 09)降解烟梗41.35%的果胶，但其产酶培养基成本高昂[9]，而本实验利用的发酵培养液中只含有烟梗、水两种成分，能显著降低酶法降解的成本。

目前测定烟草中果胶含量的方法经常采用非常繁琐的色谱法，甚至动用扫描显微镜, 只有少数采用草酸铵浸提法[10-11]。本项目采用草酸铵抽提、酸性乙醇沉淀的化学方法收集果胶以对降解效果进行评价，有望解决测定成本过高、耗时长的问题。通过发酵条件及检测条件的优化，提高了GYC501对梗丝的发酵效率，从而有效提高烟梗及梗丝的品质，增加其在卷烟配方中的适用性。

4 结论

本研究使用GYC 501在烟草梗丝培养基中发酵48 h后所得到的发酵液对烟草梗丝进行发酵处理，经优化后得到了最佳的发酵条件：在酶使用量为1536 U的情况下，温度为37 ℃，缓冲液pH为4.8，缓冲液浓度为0.3 mol/L，梗丝含水量为50%。在此条件下，梗丝果胶降解率最佳，为34.97%；最终发酵效果良好，梗丝降解率从27.2%优化到34.97%，正交优化后酶的使用量较单因素优化后减少了50%。菌株GYC 501对于改善梗丝质量有较好的应用前景，下一步将检测评吸效果及烟气成分，了解利用GYC501发酵后对梗丝成分及吸味的具体影响。

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(责任编辑：许晶晶)

Application of Pectin-degrading FungusAspergillustubingensisGYC 501 in Improvement of Tobacco Cut-stem Quality and Optimization of Its Fermentation Conditions

LONG Zhang-de1, CHEN Hao-rui2, LIU Hong1*, ZOU Ke-xing1,SUN Jian-sheng1, LI Ji-gang1, XUE Yun1, SHEN Pei-hong2*

(1. China Tobacco Guangxi Industrial Limited Company, Nanning 530001, China;2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

There are a large amount of cell wall substances such as pectin and cellulose in tobacco stem, and these substances cause bad smoking quality, thus tobacco stem application is limited in manufacture. This research treated tobacco cut-stem with the fermentation liquid ofAspergillustubingensisGYC 501 to degrade the polysaccharides (mainly being pectin) in it and to improve its smoking quality. A relative simple method for measuring the pectin content in tobacco cut-stem was built. The fermentation conditions (fermentation time, buffer solution concentration, buffer solution pH-value, fermentation temperature, pectinase application rate, and so on) of tobacco cut-stem were optimized by single-factor experiment and orthogonal test. The fermentation liquid ofA.tubingensisGYC 501, which was obtained by culturing this fungus in the tobacco cut-stem liquid medium for 48 h, was applied to ferment the tobacco cut-stem. The optimal fermentation conditions were obtained as follows: pectinase application rate 1536 U, fermentation time 12 h, fermentation temperature 42 ℃, buffer solution pH 4.8, 0.3 mol/L buffer solution, cut-stem moisture content 50%. Under the above optimum fermentation conditions, the degrading rate of pectin in tobacco cut-stem was the highest, reaching 34.97%.

Tobacco cut-stem;Aspergillustubingensis; Pectinase; Fermentation conditions optimization; Orthogonal test

2016-11-23

广西科技厅科技攻关项目(桂科攻15118006)。

龙章德(1970─)，男，高级农艺师，博士，从事烟叶原料研究。*通讯作者：刘鸿、申佩弘。

Q815

A

1001-8581(2017)02-0095-04